100mg/ml Amp Agar plate
15 g agar 溶於 1000 ml YT medium
121°C ，高壓滅菌 40 分鐘，冷卻約 55°C ，加入 1 ml ，100mg/ml
ampicillin，混合均勻，再將溶液倒於 (90x15mm) 培養皿，靜置於平衡台，待凝固，方可使用。
---------------------------------------------
Lysis Buffer
urea 8M
NaH 2 PO 4 100mM
Tris⋅Cl 10mM
以 10N NaOH 調至 pH 8.0
-----------------
CAPS transfer buffer, 500ml
CAPS 10mM
Methanol 50ml
以10N NaOH 調至 pH 11.0
---------------
Coomassie Staining Solution, 500ml
Fixing solution 500ml
Coomassie brilliant blue R-250 0.25g
--------------
Destaining Solution, 500ml
methanol 25ml
acetate acid 35 ml
H2O to 500ml
----------------
6x DNA loading dye, 15ml
100% glycerol 4.5ml
bromophenol blue 0.0375g
xylene cyanol 0.0375g
H2O to 15ml
-----------------
Fixing Solution I , 200ml
methanol 80ml
acetate acid 20ml
H2O to 200ml
---------------
Fixing Solution II , 200ml
ethenol 42ml
acetate acid 20ml
H2O to 200ml
-----------------
5x M9 medium, 500ml
Na2HPO4 15g
KH2PO4 7.5g
NaCl 1.25g
NH4Cl 2.5g
1M CaCl2 68ml
H2O to 500ml
----------------
M9 medium Need, 2 ml
1 M MgSO4 0.5ml
100% glycerol 1ml
5% vitamine B1 5ml
40mg/ml L-amino acid 0.5ml
加水至 2 ml
------------
M9 plate, 500 ml
5x M9 medium 100ml
agar 7.5g
H2O to 500ml
121°C ，高壓滅菌 40 分鐘，冷卻約 55°C ，加入 2 ml M9 medium Need，混合均勻，再將溶液倒於 (90×15mm) 培養皿，靜置於平衡台，待凝固，方可使用。
------------
10x Phosphate Buffered Saline (PBS), 1000 ml
NaCl 80g
KCl 2g
Na2HPO4⋅7H2O 15.4g
KH2PO4 2g
H2O to 1000ml
調至 pH 7.3， autoclave。
--------------------------
10x Tricine-SDS/Electrophoresis buffer, 1000 ml (pH 8.3)
Tris⋅base 120g
tricine 179g
SDS 10g
加水至1000 ml
------------------
2x SDS sample buffer, dH 2 O to 10 ml
3M Tris⋅HCl, pH 8.45 3.0ml
bromphenol blue 0.2g
SDS 0.8gm
80% glycerol 3.0ml
0.1% Phenol Red 0.2g
------------------------
Solution I, 100 ml
1M glucose 5ml
1M Tris⋅HCl, pH 8.0 2.5ml
0.5M EDTA, pH 8.0 2ml
混合後，用 0.2µm 濾膜過濾。
---------------------
Solution II
0.2 N NaOH
1% SDS
--------------------
Solution III, 100 ml
5 M potassium acetate 60ml
99.8% acetic acid 11.5ml
H2O to 100 ml
-----------------------
20x SSC, pH 7.0, 1000 ml
NaCl 175g
Na3⋅Citrate 88g
H2O to 1000ml
Autoclave
------------------------
10x TBE buffer, 1000 ml
Tris⋅Base 108g
boric acid 5.5g
0.5M EDTA, pH 8.0 40ml
----------------------
1x T.E. buffer, pH 8.0, 100ml
1M Tris⋅HCl, pH 8.0 1ml
0.5M EDTA, pH 8.0 0.2ml
H2O to 100ml
Autoclave
------------------
Transfer buffer, pH 6.8, 1000 ml
Tris⋅base 5.81g
glycine 2.93g
SDS 0.375g
methanol 200ml
H2O 1000ml
---------------------
Wash buffer
urea 8M
Na 2 HPO 4 50mM
NaCl 100mM
pipes 20mM
pH值 調至 pH 6.34
----------------------
YT medium, 1000 ml
trypton 10g
yeast extract 5g
NaCl 5g
以 NaOH 調至 pH 7.4， 121°C，高壓滅菌 40 分鐘。
--------------------------
YT plate
15 g agar 溶於 1000 ml YT medium
121°C ，高壓滅菌 40 分鐘，冷卻約 55°C ，將溶液倒於 (90x15mm) 培養皿，靜置於平衡台，待凝固，方可使用。
--------------------------
Tyrode solution, pH 7.4
NaCl 136.9 mM
KCl 2.7 mM
MgCl 2 2.1 mM
NaH 2 PO 4 0.4 mM
NaHCO 3 11.9 mM
2010年5月2日 星期日
2009年7月24日 星期五
Tris Buffer在不同溫度下的差異
(pH vs Temperature for Tris Buffer)
50 mM Tris Buffer的pH值
5°C 25°C 37°C
7.76 7.20 6.91
7.89 7.30 7.02
7.97 7.40 7.12
8.07 7.50 7.22
8.18 7.60 7.30
8.26 7.70 7.40
8.37 7.80 7.52
8.48 7.90 7.62
8.58 8.00 7.71
8.68 8.10 7.80
8.78 8.20 7.91
8.88 8.30 8.01
8.98 8.40 8.10
9.09 8.50 8.22
9.18 8.60 8.31
9.28 8.70 8.42
50 mM Tris Buffer的pH值
5°C 25°C 37°C
7.76 7.20 6.91
7.89 7.30 7.02
7.97 7.40 7.12
8.07 7.50 7.22
8.18 7.60 7.30
8.26 7.70 7.40
8.37 7.80 7.52
8.48 7.90 7.62
8.58 8.00 7.71
8.68 8.10 7.80
8.78 8.20 7.91
8.88 8.30 8.01
8.98 8.40 8.10
9.09 8.50 8.22
9.18 8.60 8.31
9.28 8.70 8.42
2009年6月12日 星期五
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-12
作者已不可考，如有人知道請告知
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（二十三）正相與反相
我們純化出鈣調蛋白之後，就開始進行一些蛋白質化學的分析。主要是蛋白酶消化，反相HPLC 分析，MALDI-TOF 質譜之類的分析。我覺得在這個課程裡面加一個質譜分析並不是那麼有用，因為基本上只是演示實驗，只是講了講皮毛而已。相比之下反相HPLC 在蛋白質純化中要重要得多。HPLC 的全稱是High Performance Liquid Chromatography （高效液相色譜），這個名稱聽起來好像很尖端的樣子，其實HPLC 組成部件非常簡單，主要是三部分，泵，柱子，和UV monitor。反相HPLC 跟一般的色譜的一個顯著不同是壓力。為了保證純化蛋白的分辨能力，反相HPLC 柱的matrix 材料顆粒非常精細，所以必須施加很大的壓力才能跑得動柱子。相比之下，反相HPLC 所需壓力比一般gel filration 柱子壓力大十倍都不止。反相HPLC 的分辨度十分驚人，遠遠超過其他色譜方法。分辨度高到什麼地步呢，我舉一個自己的例子。我原來在E.Coli 裡面表達EGF repeat，大概有7 到8KD 的樣子，然後用體外反應加上一個fucose 糖基。這個fucose 分子量只有146。就這麼小的區別，即使跑在SDS-PAGE 上也是看不出來的，但是用反相HPLC 可以很完全的把沒有糖基和修飾上糖基的EGF repeats 分成兩個峰。可見反相HPLC 有多麼強大了。
反相HPLC 雖然很強大，但是它最大的弱點是不能用來分離大的蛋白，只能用來分離小肽或者小蛋白（比如histone）。具體說起來，大於30KD 的蛋白就可能不行了。原因是洗脫相裡面用得是有機溶劑，容易使大蛋白，尤其是帶有很多二級結構的蛋白變性。
反相HPLC 為什麼叫反相(reverse phase)呢? 這其實跟正相(normal phase) HPLC 有關係。
正相HPLC 依靠提高流動相的極性來洗脫。而反相HPLC 則相反，依靠降低流動相的極性來洗脫。正相和反相HPLC 柱子的材料都是由silica gel（硅膠）構成的。反相HPLC 柱子的silica gel 上面還有衍生的alkyl group，所以疏水性強了許多。正相HPLC 一般用來分離脂類分子。脂類分子有少許極性，如果樣品溶解在有機溶劑裡面，再過柱的話，可以與柱子的silica gel 結合上。如果在流動相裡面逐漸提高極性成分，脂分子就會被洗脫下來。反相HPLC則是用來分離蛋白質的。蛋白質有部分疏水性質，過反相柱的時候，可以與silica gel 上的alkyl group 相互結合。但是如果在流動相裡面逐漸提高非極性成分（比如acetonitrile），蛋白質就會被洗脫下來。
大家可能注意到，反相HPLC 的原理和疏水作用層析的原理很相似。但是，反相HPLC裡面的蛋白質與柱子的疏水作用比一般疏水作用層析要強得多。原因就在於反相HPLC 流動相中含有TFA（三氟乙酸）。TFA 是一種強酸，所以能很有力質子化蛋白質中的羧基，是之不帶負電。同時又能與蛋白質中正電基團形成離子對，進一步增加蛋白質與柱材料的疏水相互作用。
反相HPLC 具體跑起來很簡單，主要是操作儀器，先把蛋白質樣品和0.1%TFA 的溶液混合一下，然後上樣，用0.1%TFA 衝洗若干分鐘，使得蛋白樣品和柱子結合上。然後逐漸增加流動相中的acetonitrle（乙晴）濃度，洗脫蛋白。
（二十四）尾聲
蛋白質純化第十三天，也就是最後一天的時候，大家基本上都鬆弛了下來，開始準備狂歡。先是每人發了一件紀念T shirt，然後在CSHL 的酒吧裡面開酒會，再接著就是龍蝦宴。
不過氣氛最熱烈的還是龍蝦宴之後的詩會。詩會我還是第一次碰到，要求每人寫一首跟蛋白質純化有關的詩，並且當眾朗讀，場面十分熱鬧和搞笑。我好不容易寫了一首，是這樣的：
My protein
My protein used to be wild,
Like a naughty child,
He likes to play seek and hide,
which makes me feel really tired,
But now I can find him no matter it is day or night,
Because from ***, Al, Sue-hwa and Constantin,
I have learned how to Purify!
詩會之後，絕大部分同學和老師都在活動室打乒乓球或者台球。而我由於住得近，就直接開車回學校了。回想起來，這一次的課程十分令人難忘，認識了很多新朋友，學到了很多新知識，大大開闊了眼界。當然，指望在短短的兩個星期就學會所有蛋白質純化的技術是很不現實的，但是這個課程至少讓我們認識到，蛋白質純化雖然很復雜，但是本身並不是那麼高不可攀。只要用心去揣摩和嘗試，就一定可以做得很好。
除了13 天的課程，寫這一系列學習筆記，也讓我收獲不小。因為寫的過程中，我認真的複習了所做實驗的記錄和課程的教材，對實驗設計的理解加深了好多。這也算是除了在BBS 上灌水外的一個意外收獲吧。
最後，如果有同學對蛋白質純化十分感興趣，我在此推薦兩本參考書。一本是我們這個課程的教材 Strategies for protein purification and characterization: a laboratory course manual .
Cold Spring Harbor laboratory Press。另一本是Methods in Enzymology. Vol 182, Guide to
Protein purification Academic Press.
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（二十三）正相與反相
我們純化出鈣調蛋白之後，就開始進行一些蛋白質化學的分析。主要是蛋白酶消化，反相HPLC 分析，MALDI-TOF 質譜之類的分析。我覺得在這個課程裡面加一個質譜分析並不是那麼有用，因為基本上只是演示實驗，只是講了講皮毛而已。相比之下反相HPLC 在蛋白質純化中要重要得多。HPLC 的全稱是High Performance Liquid Chromatography （高效液相色譜），這個名稱聽起來好像很尖端的樣子，其實HPLC 組成部件非常簡單，主要是三部分，泵，柱子，和UV monitor。反相HPLC 跟一般的色譜的一個顯著不同是壓力。為了保證純化蛋白的分辨能力，反相HPLC 柱的matrix 材料顆粒非常精細，所以必須施加很大的壓力才能跑得動柱子。相比之下，反相HPLC 所需壓力比一般gel filration 柱子壓力大十倍都不止。反相HPLC 的分辨度十分驚人，遠遠超過其他色譜方法。分辨度高到什麼地步呢，我舉一個自己的例子。我原來在E.Coli 裡面表達EGF repeat，大概有7 到8KD 的樣子，然後用體外反應加上一個fucose 糖基。這個fucose 分子量只有146。就這麼小的區別，即使跑在SDS-PAGE 上也是看不出來的，但是用反相HPLC 可以很完全的把沒有糖基和修飾上糖基的EGF repeats 分成兩個峰。可見反相HPLC 有多麼強大了。
反相HPLC 雖然很強大，但是它最大的弱點是不能用來分離大的蛋白，只能用來分離小肽或者小蛋白（比如histone）。具體說起來，大於30KD 的蛋白就可能不行了。原因是洗脫相裡面用得是有機溶劑，容易使大蛋白，尤其是帶有很多二級結構的蛋白變性。
反相HPLC 為什麼叫反相(reverse phase)呢? 這其實跟正相(normal phase) HPLC 有關係。
正相HPLC 依靠提高流動相的極性來洗脫。而反相HPLC 則相反，依靠降低流動相的極性來洗脫。正相和反相HPLC 柱子的材料都是由silica gel（硅膠）構成的。反相HPLC 柱子的silica gel 上面還有衍生的alkyl group，所以疏水性強了許多。正相HPLC 一般用來分離脂類分子。脂類分子有少許極性，如果樣品溶解在有機溶劑裡面，再過柱的話，可以與柱子的silica gel 結合上。如果在流動相裡面逐漸提高極性成分，脂分子就會被洗脫下來。反相HPLC則是用來分離蛋白質的。蛋白質有部分疏水性質，過反相柱的時候，可以與silica gel 上的alkyl group 相互結合。但是如果在流動相裡面逐漸提高非極性成分（比如acetonitrile），蛋白質就會被洗脫下來。
大家可能注意到，反相HPLC 的原理和疏水作用層析的原理很相似。但是，反相HPLC裡面的蛋白質與柱子的疏水作用比一般疏水作用層析要強得多。原因就在於反相HPLC 流動相中含有TFA（三氟乙酸）。TFA 是一種強酸，所以能很有力質子化蛋白質中的羧基，是之不帶負電。同時又能與蛋白質中正電基團形成離子對，進一步增加蛋白質與柱材料的疏水相互作用。
反相HPLC 具體跑起來很簡單，主要是操作儀器，先把蛋白質樣品和0.1%TFA 的溶液混合一下，然後上樣，用0.1%TFA 衝洗若干分鐘，使得蛋白樣品和柱子結合上。然後逐漸增加流動相中的acetonitrle（乙晴）濃度，洗脫蛋白。
（二十四）尾聲
蛋白質純化第十三天，也就是最後一天的時候，大家基本上都鬆弛了下來，開始準備狂歡。先是每人發了一件紀念T shirt，然後在CSHL 的酒吧裡面開酒會，再接著就是龍蝦宴。
不過氣氛最熱烈的還是龍蝦宴之後的詩會。詩會我還是第一次碰到，要求每人寫一首跟蛋白質純化有關的詩，並且當眾朗讀，場面十分熱鬧和搞笑。我好不容易寫了一首，是這樣的：
My protein
My protein used to be wild,
Like a naughty child,
He likes to play seek and hide,
which makes me feel really tired,
But now I can find him no matter it is day or night,
Because from ***, Al, Sue-hwa and Constantin,
I have learned how to Purify!
詩會之後，絕大部分同學和老師都在活動室打乒乓球或者台球。而我由於住得近，就直接開車回學校了。回想起來，這一次的課程十分令人難忘，認識了很多新朋友，學到了很多新知識，大大開闊了眼界。當然，指望在短短的兩個星期就學會所有蛋白質純化的技術是很不現實的，但是這個課程至少讓我們認識到，蛋白質純化雖然很復雜，但是本身並不是那麼高不可攀。只要用心去揣摩和嘗試，就一定可以做得很好。
除了13 天的課程，寫這一系列學習筆記，也讓我收獲不小。因為寫的過程中，我認真的複習了所做實驗的記錄和課程的教材，對實驗設計的理解加深了好多。這也算是除了在BBS 上灌水外的一個意外收獲吧。
最後，如果有同學對蛋白質純化十分感興趣，我在此推薦兩本參考書。一本是我們這個課程的教材 Strategies for protein purification and characterization: a laboratory course manual .
Cold Spring Harbor laboratory Press。另一本是Methods in Enzymology. Vol 182, Guide to
Protein purification Academic Press.
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-11
作者已不可考，如有人知道請告知
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（二十一）離子交換層析
做完硫酸銨沉澱以及等電點沉澱之後，下一步就是做離子交換層析(ion-exchange chromatography)。離子交換層析原理很簡單，利用蛋白質表面的帶電基團和resin上帶相反電荷的ion exchanger group 相互結合來純化蛋白。離子交換柱和affinity chromatography一樣，屬於absorption/desorption 型的層析方法，與gel filtration 完全不一樣，其中一個最大的優點
是，樣品體積可以很大，最後的洗脫樣品的體積可以小很多，這樣實際起到了一個濃縮樣品的作用。還有一個優點是，離子交換層析其實不需要柱子，可以用batch 的方法（在離心管裡面混合beads 和樣品）。當然如果beads 量多情況下，batch 方法平衡得不是很好，導致resolution 不是很好。這一點我們做實驗的時候深有體會，以後的一篇中我會提到。我們純化鈣調蛋白用了柱子做純化，原因是因為所用的beads 相當於Sephadex G50 再加上陰離子交換基團，所以實際上可以看成是ion-exchange 和gel filtration 的混合體。 Calmodulin 分子量比較小，所以很容易和分子量大的雜蛋白分開。
離子交換柱分為陽離子交換柱和陰離子交換柱，前者主要用來純化偏堿性的蛋白質，後者則用來純化偏酸性的蛋白質。絕大部分蛋白都偏酸性，所以陰離子交換柱用得更加普遍一些。常用的陽離子交換劑主要有Carboxymethyl 和sulfopropyl 兩種。Carboxymethyl 比sulfopropyl 要弱一些，所以同樣的蛋白與這兩種基團結合，後者的洗脫鹽濃度得高一些。常用的陰離子交換劑有DEAE(diethyl aminoehtyl)和Quaternary amine 兩種。後者比前者強，適用的pH 也更寬。選用何種離子交換劑要根據實際要純化蛋白的性質來決定。比如我們純化鈣調蛋白就用的是弱的陰離子交換柱DEAE，因為前面我提過，鈣調蛋白的pI 很低，蛋白很酸，與弱的陰離子交換劑也能結合得很好。而很多其它的雜蛋白沒有這麼酸，所以結合不上。這樣，用DEAE 實際上可以有效的除去很多雜質。
離子交換柱真正跑起來時非常簡單，沒有什麼技術含量，但是第一次純化一種蛋白的時
候，一定得先摸清起始條件。
首先要確定用什麼緩衝液。緩衝物由於自己帶電，所以也可以與ion-exchanger 結合。
這種結合會帶來兩方面的干擾，一個是降低了緩衝物的濃度，因而降低了緩衝能力，另一個是與蛋白質競爭ion-exchanger。所以呢，如果用陰離子交換柱， 要避免用磷酸buffer 之類的帶負電的緩衝物，如果用陽離子交換柱，則要避免用Tris buffer 之類的帶正電的緩衝物。有的緩衝物是兩性離子(zwitterionic)，比如HEPES，所以陰陽兩種離子交換層析都適用。如果待純化的蛋白是膜蛋白，要用去垢劑，則應該選用非離子型或者兩性離子型的去垢劑，道理跟上面是一樣的。
第二個要注意的起始條件是pH。有些時候要分離的蛋白的活性對pH 非常敏感，所以pH 沒有太多選擇。但很多情況，應該根據待純化蛋白的性質而進行選擇。以陰離子交換柱為例，如果蛋白結合得不好，可以提高一下pH,如果蛋白結合得太緊，需要高鹽洗脫的話，則應該降低一下pH。要確定最適合的pH，可以做一個簡單的小實驗（以陰離子交換柱為例）。配pH 從5.0 到9.0，間隔為0.5 的一系列緩衝液。用這些buffer 先把beads 平衡好了，然後向每一種pH 平衡好的beads 裡面加一小等分的樣品。孵育之後，取上清測活。如果蛋白質結合上去了，上清的活性就沒有了。然後，取比活性剛剛開始結合的pH 高0.5 單位的pH作為離子交換層析實驗的pH。注意，這裡pH 不是越高越好，pH 太高，雜蛋白也能結合上，會降低ion-exchanger 的capacity。確定了buffer 和pH, 下一步要確定的是上樣時的起始離子強度，也就是樣品起始鹽濃度。用來確定鹽濃度的小實驗是這麼做的，配一系列鹽濃度從0.1M 到1M（間隔0.1M)的緩衝液。用這些buffer 平衡 beads，然後加入一小等分的樣品，孵育之後，取上清測活。低鹽濃度下的上清應該沒有活性，因為蛋白可以與beads 結合，較高鹽濃度下, 上清中應開始出現活性。 然後選擇剛剛低於洗脫蛋白所需鹽濃度的濃度作為樣品的起始鹽濃度。這樣做的好處是, 一些與ionexchanger 結合較弱的雜蛋白，一開始就不會結合到beads 上去。另外，實際跑樣品之前，如果樣品體積比較大（比如數百毫升），必須測一下電導率以確定起始鹽濃度符合要求。如果低了，就應該加鹽，高了，就應該加水。
（二十二）失敗中的啟示
離子交換層析之後是最後一步純化，疏水作用層析(hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)。HIC 和硫酸銨沉澱是同一個原理。蛋白質表面有一些疏水區域，如果在蛋白質樣品溶液裡面加足夠的鹽，就會與這些疏水區域爭奪水分子。沒有了足夠的分子，這些疏水區域傾向於與其他疏水區域結合。HIC 的beads 上衍生有非極性基團，可以與蛋白質的疏水區域結合，這樣蛋白質就能bind 到柱子上。要想把蛋白質洗脫下來，則要用低鹽緩衝液衝洗，鹽濃度下降之後蛋白質與柱子的疏水相互作用也被削弱，所以能被衝洗下來。
由於HIC 要求樣品的起始鹽濃度很高，所以特別適於作為硫酸銨沉澱或者離子交換層析後續步驟。因為硫酸銨沉澱（無論是上清還是沉澱）和離子交換層析的產物，鹽濃度都非常高，如果直接再跑HIC，不但省了透析脫鹽的一步，還進一步純化了蛋白。現在常用的HIC resin上的疏水基團有兩種，一種是Phenyl 另一種是Octyl。比較而言，Octyl group 更加疏水一些。我們這一次的實驗中用的是Phenyl sepharose。值得強調的是，對於HIC 而言，resin 的衍生基團並不是越疏水就越好的。因為如果太疏水的話，與蛋白質的結合會十分緊密，以至於要加入有機溶劑，才能衝洗下來。但是有機溶劑同時又有可能使蛋白變性。疏水作用層析特別適用於純化鈣調蛋白。因為鈣調蛋白在有鈣離子結合的條件下，高度疏水，即使在低鹽濃度下也可以很牢固的與HIC column 結合。洗脫鈣調蛋白時，用含有EDTA 或者EGTA 的緩衝液。失去鈣離子的鈣調蛋白疏水性會降低很多, 這樣很容易被沖洗下來。
HIC 這一步，我感覺要比前一步離子交換有用的多。為什麼呢，這要從我們一組實驗中的失敗說起。跑DEAE 柱子需要我們自己裝柱，大小跟過去跑S-300 柱子差不多，裝好柱子之後我們就開始上樣。起初這個柱子沒什麼問題，但在樣品快要上完的時候，不知為何柱子裡面大量的beads 漏到了柱子的玻璃保溫夾層裡面。我們一看大事不好，只好把柱子停了，然後把beads 全掏了出來，准備用batch 的方法來洗脫蛋白。我們用了一個tissue culture 過濾media 的過濾器來做這件事情。beads 放在過濾漏鬥裡面，加含鹽的緩衝液攪拌洗滌，然後抽真空讓液體過濾出來。按道理，絕大部分鈣調蛋白應該被0.9M NaCl 的buffer 衝洗下來。
但是我們又發生了意外，衝洗的過程中過濾器被碰倒了，beads 和洗脫液撒了一桌子！眼看要成功了，竟然發生這種倒霉事情，全組人都很depressed，都有一種要就義的感覺。教員Constantin 比較有經驗，他要我們把0.9M NaCl 之前的低鹽洗脫液混在一起直接做下一步疏水作用層析。這樣一來，我們等於繞過了離子交換這一步。最後純化純化出來的蛋白讓我們大吃一驚，不但非常純不說，總量大概有幾十個毫克，跟手冊上給的通常產量差不多。這個結果說明一個問題，就是離子交換這一步雖然看起來很fancy，但對於鈣調蛋白的純化並不是那麼重要。蛋白質純化的步驟並不是越復雜越好，簡單，快速，便宜的步驟才是最好的。
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（二十一）離子交換層析
做完硫酸銨沉澱以及等電點沉澱之後，下一步就是做離子交換層析(ion-exchange chromatography)。離子交換層析原理很簡單，利用蛋白質表面的帶電基團和resin上帶相反電荷的ion exchanger group 相互結合來純化蛋白。離子交換柱和affinity chromatography一樣，屬於absorption/desorption 型的層析方法，與gel filtration 完全不一樣，其中一個最大的優點
是，樣品體積可以很大，最後的洗脫樣品的體積可以小很多，這樣實際起到了一個濃縮樣品的作用。還有一個優點是，離子交換層析其實不需要柱子，可以用batch 的方法（在離心管裡面混合beads 和樣品）。當然如果beads 量多情況下，batch 方法平衡得不是很好，導致resolution 不是很好。這一點我們做實驗的時候深有體會，以後的一篇中我會提到。我們純化鈣調蛋白用了柱子做純化，原因是因為所用的beads 相當於Sephadex G50 再加上陰離子交換基團，所以實際上可以看成是ion-exchange 和gel filtration 的混合體。 Calmodulin 分子量比較小，所以很容易和分子量大的雜蛋白分開。
離子交換柱分為陽離子交換柱和陰離子交換柱，前者主要用來純化偏堿性的蛋白質，後者則用來純化偏酸性的蛋白質。絕大部分蛋白都偏酸性，所以陰離子交換柱用得更加普遍一些。常用的陽離子交換劑主要有Carboxymethyl 和sulfopropyl 兩種。Carboxymethyl 比sulfopropyl 要弱一些，所以同樣的蛋白與這兩種基團結合，後者的洗脫鹽濃度得高一些。常用的陰離子交換劑有DEAE(diethyl aminoehtyl)和Quaternary amine 兩種。後者比前者強，適用的pH 也更寬。選用何種離子交換劑要根據實際要純化蛋白的性質來決定。比如我們純化鈣調蛋白就用的是弱的陰離子交換柱DEAE，因為前面我提過，鈣調蛋白的pI 很低，蛋白很酸，與弱的陰離子交換劑也能結合得很好。而很多其它的雜蛋白沒有這麼酸，所以結合不上。這樣，用DEAE 實際上可以有效的除去很多雜質。
離子交換柱真正跑起來時非常簡單，沒有什麼技術含量，但是第一次純化一種蛋白的時
候，一定得先摸清起始條件。
首先要確定用什麼緩衝液。緩衝物由於自己帶電，所以也可以與ion-exchanger 結合。
這種結合會帶來兩方面的干擾，一個是降低了緩衝物的濃度，因而降低了緩衝能力，另一個是與蛋白質競爭ion-exchanger。所以呢，如果用陰離子交換柱， 要避免用磷酸buffer 之類的帶負電的緩衝物，如果用陽離子交換柱，則要避免用Tris buffer 之類的帶正電的緩衝物。有的緩衝物是兩性離子(zwitterionic)，比如HEPES，所以陰陽兩種離子交換層析都適用。如果待純化的蛋白是膜蛋白，要用去垢劑，則應該選用非離子型或者兩性離子型的去垢劑，道理跟上面是一樣的。
第二個要注意的起始條件是pH。有些時候要分離的蛋白的活性對pH 非常敏感，所以pH 沒有太多選擇。但很多情況，應該根據待純化蛋白的性質而進行選擇。以陰離子交換柱為例，如果蛋白結合得不好，可以提高一下pH,如果蛋白結合得太緊，需要高鹽洗脫的話，則應該降低一下pH。要確定最適合的pH，可以做一個簡單的小實驗（以陰離子交換柱為例）。配pH 從5.0 到9.0，間隔為0.5 的一系列緩衝液。用這些buffer 先把beads 平衡好了，然後向每一種pH 平衡好的beads 裡面加一小等分的樣品。孵育之後，取上清測活。如果蛋白質結合上去了，上清的活性就沒有了。然後，取比活性剛剛開始結合的pH 高0.5 單位的pH作為離子交換層析實驗的pH。注意，這裡pH 不是越高越好，pH 太高，雜蛋白也能結合上，會降低ion-exchanger 的capacity。確定了buffer 和pH, 下一步要確定的是上樣時的起始離子強度，也就是樣品起始鹽濃度。用來確定鹽濃度的小實驗是這麼做的，配一系列鹽濃度從0.1M 到1M（間隔0.1M)的緩衝液。用這些buffer 平衡 beads，然後加入一小等分的樣品，孵育之後，取上清測活。低鹽濃度下的上清應該沒有活性，因為蛋白可以與beads 結合，較高鹽濃度下, 上清中應開始出現活性。 然後選擇剛剛低於洗脫蛋白所需鹽濃度的濃度作為樣品的起始鹽濃度。這樣做的好處是, 一些與ionexchanger 結合較弱的雜蛋白，一開始就不會結合到beads 上去。另外，實際跑樣品之前，如果樣品體積比較大（比如數百毫升），必須測一下電導率以確定起始鹽濃度符合要求。如果低了，就應該加鹽，高了，就應該加水。
（二十二）失敗中的啟示
離子交換層析之後是最後一步純化，疏水作用層析(hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)。HIC 和硫酸銨沉澱是同一個原理。蛋白質表面有一些疏水區域，如果在蛋白質樣品溶液裡面加足夠的鹽，就會與這些疏水區域爭奪水分子。沒有了足夠的分子，這些疏水區域傾向於與其他疏水區域結合。HIC 的beads 上衍生有非極性基團，可以與蛋白質的疏水區域結合，這樣蛋白質就能bind 到柱子上。要想把蛋白質洗脫下來，則要用低鹽緩衝液衝洗，鹽濃度下降之後蛋白質與柱子的疏水相互作用也被削弱，所以能被衝洗下來。
由於HIC 要求樣品的起始鹽濃度很高，所以特別適於作為硫酸銨沉澱或者離子交換層析後續步驟。因為硫酸銨沉澱（無論是上清還是沉澱）和離子交換層析的產物，鹽濃度都非常高，如果直接再跑HIC，不但省了透析脫鹽的一步，還進一步純化了蛋白。現在常用的HIC resin上的疏水基團有兩種，一種是Phenyl 另一種是Octyl。比較而言，Octyl group 更加疏水一些。我們這一次的實驗中用的是Phenyl sepharose。值得強調的是，對於HIC 而言，resin 的衍生基團並不是越疏水就越好的。因為如果太疏水的話，與蛋白質的結合會十分緊密，以至於要加入有機溶劑，才能衝洗下來。但是有機溶劑同時又有可能使蛋白變性。疏水作用層析特別適用於純化鈣調蛋白。因為鈣調蛋白在有鈣離子結合的條件下，高度疏水，即使在低鹽濃度下也可以很牢固的與HIC column 結合。洗脫鈣調蛋白時，用含有EDTA 或者EGTA 的緩衝液。失去鈣離子的鈣調蛋白疏水性會降低很多, 這樣很容易被沖洗下來。
HIC 這一步，我感覺要比前一步離子交換有用的多。為什麼呢，這要從我們一組實驗中的失敗說起。跑DEAE 柱子需要我們自己裝柱，大小跟過去跑S-300 柱子差不多，裝好柱子之後我們就開始上樣。起初這個柱子沒什麼問題，但在樣品快要上完的時候，不知為何柱子裡面大量的beads 漏到了柱子的玻璃保溫夾層裡面。我們一看大事不好，只好把柱子停了，然後把beads 全掏了出來，准備用batch 的方法來洗脫蛋白。我們用了一個tissue culture 過濾media 的過濾器來做這件事情。beads 放在過濾漏鬥裡面，加含鹽的緩衝液攪拌洗滌，然後抽真空讓液體過濾出來。按道理，絕大部分鈣調蛋白應該被0.9M NaCl 的buffer 衝洗下來。
但是我們又發生了意外，衝洗的過程中過濾器被碰倒了，beads 和洗脫液撒了一桌子！眼看要成功了，竟然發生這種倒霉事情，全組人都很depressed，都有一種要就義的感覺。教員Constantin 比較有經驗，他要我們把0.9M NaCl 之前的低鹽洗脫液混在一起直接做下一步疏水作用層析。這樣一來，我們等於繞過了離子交換這一步。最後純化純化出來的蛋白讓我們大吃一驚，不但非常純不說，總量大概有幾十個毫克，跟手冊上給的通常產量差不多。這個結果說明一個問題，就是離子交換這一步雖然看起來很fancy，但對於鈣調蛋白的純化並不是那麼重要。蛋白質純化的步驟並不是越復雜越好，簡單，快速，便宜的步驟才是最好的。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-10
作者已不可考，如有人知道請告知
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（十九）MDA-BF-1的啟示
凝集素層析實際操作起來很簡單，跟過簡單的Ni 柱子一樣。拿到洗脫的蛋白之後，我們就著手開始測活，分析純化的效率和倍數。胰島素受體不是酶，所以測活是利用胰島素與受體的特異結合。具體的測活步驟非常簡單，就是把I-125 標記的胰島素和純化的組分混合然後孵育一段時間。然後加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000 沉澱胰島素受體，而游離的胰島素不會被沉澱下來。說到PEG 沉澱，Dr.Lin 講了她自己鬧的一個笑話。是這樣的，她實驗室發現了一個蛋白質因子 MDA-BF-1。這個因子對Osteoblast（成骨細胞）的增長有促進作用。然後呢，她就想把這個因子的受體給找出來。首先一步呢，就是得有一個測活方法。
所以她就比照insulin receptor 的測活方法而設計了一個方法, 其中連PEG 沉澱都是一樣的。結果呢，這個測活試驗完全失敗了。問題出在PEG 沉澱這一步。PEG 作為一種多元醇，可以想像為一種“分子海綿”，可以吸附水分子。這樣樣品中蛋白的有效濃度實際變大了好多，容易出現聚集然後沉澱的現像。這就是為什麼insuline receptor 可以被沉澱下來的原因。而游離的胰島素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉澱不下來。而Dr. Lin 發現的MDA-BF-1 因子，分子量相對insulin 大了好多，有50 多KD，所以游離的因子也能被PEG 沉澱下來。聽完這個小插曲，我感覺挺吃驚，作為一個有經驗的教授，Dr.Lin 在沒弄清楚原理的情況下竟然就胡亂套用protocol 。所以呢，我感覺做實驗，僅僅是follow protocol 把實驗完成了，是遠遠不夠的。一定得搞清楚原理是怎麼回事，這樣出了問題才知道怎麼去改進。
MDA-BF-1 不僅僅給我以上的啟示。Dr.Lin 給我們做了一個seminar， 講述她的研究進展。其中她重點談到了MDA-BF-1 這個因子。 她實驗室現在正在做的是試圖用蛋白質純化的辦法來找出MDA-BF-1 的受體。她的測活方法是這樣的，首先表達MDA-BF1 的重組蛋白，然後用同位素標記，然後做binding assay。這個binding assay 很麻煩，因為沒辦法用簡單的手段把游離的MDA-BF-1 和與受體結合上的MDA-BF-1 分開，只能用gel filtration column 來分開，每做一次assay 都很麻煩。雖然Dr.Lin 提到她們還沒有找到那個受體，我個人覺得這個方法不是很明智。為什麼呢?純化蛋白的過程中，各種膜蛋白都處於一種被去垢劑溶解的勻漿狀態，這種情況下，一些正常生理條件下不會與MDA-BF1 結合的受體可能也會與其結合。 這樣一來，純化出來的東西就是亂七八糟的了。另外一種可能性是: 有很多膜蛋白能與MDA-BF-1 相互作用， 但是只有一種膜蛋白能夠啟動下游的信號傳導，促進Osteoblast 的增長。這種binding assay 的測活方法雖然可以找出與MDA-BF-1 結合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本沒有信號傳導的功能。需要強調的是，蛋白質純化絕對不是萬能的。要想純化出一個未知蛋白，最最重要的是要有一個簡單明了直接的測活方法。
Dr.Lin 實驗的問題，說到底，就是沒有好的測活方法。
這一個模塊的純化試驗到此就為止了。我們測活之後，比較了各種去垢劑的純化效率，發現Triton , CHAPS, Octyl Glucoside 都還比較好，Sodium Cholate 則差好多。原始的實驗手冊上還有進一步的insulin affinity chromatography 和其他分析。而教員為了滿足很多學生做做重組蛋白表達純化的願望，用一些比較白痴的的實驗取代了原有很經典的實驗。比如一個實驗是從SF9 裡面純化一個his tag 的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做這個試驗之後，幾乎要抓狂了。我這一組其他幾個人還把這個試驗當寶，搶著做。而我最後選擇去跑了一個2D gel。就這樣，第三個模塊的實驗結束了。
（二十）鈣調蛋白
純化胰島素受體的模塊結束之後，我們這一組人進入到最後一個模塊，做鈣調蛋白的純化和分析。鈣調蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細胞裡面都能找到。這個蛋白只有148 個氨基酸，大概16KD，比較小。有Ca2+結合的情況下，鈣調蛋白的構像可以發生較大的改變，從而激活一系列酶的活性，比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些protein kinases, phosphatases 和ATPase 等等。這一個模塊的實驗中，我們是從雞胗裡面提取和純化鈣調蛋白，然後再做一些分析。
這一個模塊的純化設計，可以說是最大限度的利用了鈣調蛋白的特殊性質，我覺得設計的很精彩。不過我對這個模塊的實驗經歷並不是很滿意。教員的實驗助手只有一個人，而且非常不稱職，對實驗本身似乎不太了解，也不是很helpful，感覺比前幾個模塊的實驗助手差多了。教員叫Constantin，是一個俄羅斯人，在rutgers 當教授。我起初對他印像不佳，後來發現這個人其實很nice,非常和藹。整個純化步驟大概是這樣的。首先把雞胗剁碎勻漿，然後做粗分離，用硫酸銨沉澱的辦法把雜蛋白都沉澱下來。然後再做等電點沉澱，把Calmodulin 沉澱下來。重溶沉澱之後再做透析來脫鹽。然後再過陰離子交換柱DEAE Sephadex A-50。純化出來的組分再過疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin 了，用Commassie blue 都可以染出來。我們做的實驗中沒有對Calmodulin 的測活實驗，可能是因為最後純化出來的Calmodulin很多,可以做光譜分析之類的實驗進行分析，所以就省掉了。但我多少有一點本末倒置的感覺。因為對未知蛋白質純化，首先就得有一個靠的住的測活方法, 然後才能逐漸制定最優化的純化策略。另外，在設計測活方法之前，還必須搞清楚，有生物活性的物質是不是蛋白質。
一般有下列幾種方法。(1)對protease 的是否敏感。(2)生物活性不會因為透析而丟掉(3)Urea之類的變性劑是否降低生物活性(4)對化學修飾劑(比如sulfur hydryl blocker idoacetamide)是
否敏感。
我們提取鈣調蛋白所用的組織原料，雞胗，量挺大的，有一斤之多，紅紅的一大堆肉。這樣的組織，勻漿是一件很麻煩的事情，所以我們用了一個大號的勻漿機，試圖把肉都搗爛。但是效果不好，重復了兩次，還是有很多肉沒有被弄碎，所以只好扔掉了。值得強調的是，對於這樣大量組織的勻漿，緩衝液的配方必須有所考慮。首先，離子強度要低一點，高離子強度容易導致蛋白質聚集和沉澱；其次，最好加如EDTA 之類金屬離子螯合劑。這是因為組織裡面會有很多二價陽離子，有可能會與組織裡面的一些無機鹽（比如磷酸鹽）反應產生沉澱，導致勻漿中蛋白質不能完全溶解。最後，如果要在後續步驟中過陽離子交換柱，要避免有primary amine 的緩衝物（比如tris），如果要過陰離子交換柱，則要避免用磷酸buffer。我們拿到勻漿之後，然後過濾。接著的一步就是硫酸銨沉澱。硫酸銨沉澱的原理我前面提到過，所以就不多說了。我們用了飽和硫酸銨濃度（６０％）來沉澱。鈣調蛋白這個東東很奇怪，沒有鈣離子結合的情況下很親水，所以即使用飽和硫酸銨，也沉澱不下來。但大量的雜蛋白都能被沉澱下來。當然也不是所有的雜蛋白，至少血紅蛋白就不行，因為硫酸銨沉澱後的上清還是紅色的。下一步呢，就是等電點沉澱。鈣調蛋白是一個很酸的蛋白，等電點只有4.05，所以可以加硫酸使pH 降到4.05 附近，蛋白總電荷為零，就容易聚集沉澱。我的感覺是，等電點沉澱並不是很可靠的方法，因為很難保證沉澱過程中蛋白會不會變性。搞不好，蛋白沉澱後就沒法重溶了。鈣調蛋白溶解性比較好，也比較皮實，重溶起來比較容易。
重溶用的是Tris 的溶液，由於這個時候樣品溶液裡面鹽濃度很高，不能直接上樣到下一步的離子交換柱上，所以需要透析。我們先把樣品放到蒸餾水中透析兩三個小時，然後再換到一般的緩衝液裡。透析大家估計都熟悉，也沒有什麼技術含量。只有兩點值得注意，首先，透析袋不能裝滿，因為透析過程中樣品體積會增加。其次，透析袋空的地方要弄癟，不能留空氣，否則樣品體積增大後，扎緊的透析袋可能會受壓而破裂。
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（十九）MDA-BF-1的啟示
凝集素層析實際操作起來很簡單，跟過簡單的Ni 柱子一樣。拿到洗脫的蛋白之後，我們就著手開始測活，分析純化的效率和倍數。胰島素受體不是酶，所以測活是利用胰島素與受體的特異結合。具體的測活步驟非常簡單，就是把I-125 標記的胰島素和純化的組分混合然後孵育一段時間。然後加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000 沉澱胰島素受體，而游離的胰島素不會被沉澱下來。說到PEG 沉澱，Dr.Lin 講了她自己鬧的一個笑話。是這樣的，她實驗室發現了一個蛋白質因子 MDA-BF-1。這個因子對Osteoblast（成骨細胞）的增長有促進作用。然後呢，她就想把這個因子的受體給找出來。首先一步呢，就是得有一個測活方法。
所以她就比照insulin receptor 的測活方法而設計了一個方法, 其中連PEG 沉澱都是一樣的。結果呢，這個測活試驗完全失敗了。問題出在PEG 沉澱這一步。PEG 作為一種多元醇，可以想像為一種“分子海綿”，可以吸附水分子。這樣樣品中蛋白的有效濃度實際變大了好多，容易出現聚集然後沉澱的現像。這就是為什麼insuline receptor 可以被沉澱下來的原因。而游離的胰島素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉澱不下來。而Dr. Lin 發現的MDA-BF-1 因子，分子量相對insulin 大了好多，有50 多KD，所以游離的因子也能被PEG 沉澱下來。聽完這個小插曲，我感覺挺吃驚，作為一個有經驗的教授，Dr.Lin 在沒弄清楚原理的情況下竟然就胡亂套用protocol 。所以呢，我感覺做實驗，僅僅是follow protocol 把實驗完成了，是遠遠不夠的。一定得搞清楚原理是怎麼回事，這樣出了問題才知道怎麼去改進。
MDA-BF-1 不僅僅給我以上的啟示。Dr.Lin 給我們做了一個seminar， 講述她的研究進展。其中她重點談到了MDA-BF-1 這個因子。 她實驗室現在正在做的是試圖用蛋白質純化的辦法來找出MDA-BF-1 的受體。她的測活方法是這樣的，首先表達MDA-BF1 的重組蛋白，然後用同位素標記，然後做binding assay。這個binding assay 很麻煩，因為沒辦法用簡單的手段把游離的MDA-BF-1 和與受體結合上的MDA-BF-1 分開，只能用gel filtration column 來分開，每做一次assay 都很麻煩。雖然Dr.Lin 提到她們還沒有找到那個受體，我個人覺得這個方法不是很明智。為什麼呢?純化蛋白的過程中，各種膜蛋白都處於一種被去垢劑溶解的勻漿狀態，這種情況下，一些正常生理條件下不會與MDA-BF1 結合的受體可能也會與其結合。 這樣一來，純化出來的東西就是亂七八糟的了。另外一種可能性是: 有很多膜蛋白能與MDA-BF-1 相互作用， 但是只有一種膜蛋白能夠啟動下游的信號傳導，促進Osteoblast 的增長。這種binding assay 的測活方法雖然可以找出與MDA-BF-1 結合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本沒有信號傳導的功能。需要強調的是，蛋白質純化絕對不是萬能的。要想純化出一個未知蛋白，最最重要的是要有一個簡單明了直接的測活方法。
Dr.Lin 實驗的問題，說到底，就是沒有好的測活方法。
這一個模塊的純化試驗到此就為止了。我們測活之後，比較了各種去垢劑的純化效率，發現Triton , CHAPS, Octyl Glucoside 都還比較好，Sodium Cholate 則差好多。原始的實驗手冊上還有進一步的insulin affinity chromatography 和其他分析。而教員為了滿足很多學生做做重組蛋白表達純化的願望，用一些比較白痴的的實驗取代了原有很經典的實驗。比如一個實驗是從SF9 裡面純化一個his tag 的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做這個試驗之後，幾乎要抓狂了。我這一組其他幾個人還把這個試驗當寶，搶著做。而我最後選擇去跑了一個2D gel。就這樣，第三個模塊的實驗結束了。
（二十）鈣調蛋白
純化胰島素受體的模塊結束之後，我們這一組人進入到最後一個模塊，做鈣調蛋白的純化和分析。鈣調蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細胞裡面都能找到。這個蛋白只有148 個氨基酸，大概16KD，比較小。有Ca2+結合的情況下，鈣調蛋白的構像可以發生較大的改變，從而激活一系列酶的活性，比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些protein kinases, phosphatases 和ATPase 等等。這一個模塊的實驗中，我們是從雞胗裡面提取和純化鈣調蛋白，然後再做一些分析。
這一個模塊的純化設計，可以說是最大限度的利用了鈣調蛋白的特殊性質，我覺得設計的很精彩。不過我對這個模塊的實驗經歷並不是很滿意。教員的實驗助手只有一個人，而且非常不稱職，對實驗本身似乎不太了解，也不是很helpful，感覺比前幾個模塊的實驗助手差多了。教員叫Constantin，是一個俄羅斯人，在rutgers 當教授。我起初對他印像不佳，後來發現這個人其實很nice,非常和藹。整個純化步驟大概是這樣的。首先把雞胗剁碎勻漿，然後做粗分離，用硫酸銨沉澱的辦法把雜蛋白都沉澱下來。然後再做等電點沉澱，把Calmodulin 沉澱下來。重溶沉澱之後再做透析來脫鹽。然後再過陰離子交換柱DEAE Sephadex A-50。純化出來的組分再過疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin 了，用Commassie blue 都可以染出來。我們做的實驗中沒有對Calmodulin 的測活實驗，可能是因為最後純化出來的Calmodulin很多,可以做光譜分析之類的實驗進行分析，所以就省掉了。但我多少有一點本末倒置的感覺。因為對未知蛋白質純化，首先就得有一個靠的住的測活方法, 然後才能逐漸制定最優化的純化策略。另外，在設計測活方法之前，還必須搞清楚，有生物活性的物質是不是蛋白質。
一般有下列幾種方法。(1)對protease 的是否敏感。(2)生物活性不會因為透析而丟掉(3)Urea之類的變性劑是否降低生物活性(4)對化學修飾劑(比如sulfur hydryl blocker idoacetamide)是
否敏感。
我們提取鈣調蛋白所用的組織原料，雞胗，量挺大的，有一斤之多，紅紅的一大堆肉。這樣的組織，勻漿是一件很麻煩的事情，所以我們用了一個大號的勻漿機，試圖把肉都搗爛。但是效果不好，重復了兩次，還是有很多肉沒有被弄碎，所以只好扔掉了。值得強調的是，對於這樣大量組織的勻漿，緩衝液的配方必須有所考慮。首先，離子強度要低一點，高離子強度容易導致蛋白質聚集和沉澱；其次，最好加如EDTA 之類金屬離子螯合劑。這是因為組織裡面會有很多二價陽離子，有可能會與組織裡面的一些無機鹽（比如磷酸鹽）反應產生沉澱，導致勻漿中蛋白質不能完全溶解。最後，如果要在後續步驟中過陽離子交換柱，要避免有primary amine 的緩衝物（比如tris），如果要過陰離子交換柱，則要避免用磷酸buffer。我們拿到勻漿之後，然後過濾。接著的一步就是硫酸銨沉澱。硫酸銨沉澱的原理我前面提到過，所以就不多說了。我們用了飽和硫酸銨濃度（６０％）來沉澱。鈣調蛋白這個東東很奇怪，沒有鈣離子結合的情況下很親水，所以即使用飽和硫酸銨，也沉澱不下來。但大量的雜蛋白都能被沉澱下來。當然也不是所有的雜蛋白，至少血紅蛋白就不行，因為硫酸銨沉澱後的上清還是紅色的。下一步呢，就是等電點沉澱。鈣調蛋白是一個很酸的蛋白，等電點只有4.05，所以可以加硫酸使pH 降到4.05 附近，蛋白總電荷為零，就容易聚集沉澱。我的感覺是，等電點沉澱並不是很可靠的方法，因為很難保證沉澱過程中蛋白會不會變性。搞不好，蛋白沉澱後就沒法重溶了。鈣調蛋白溶解性比較好，也比較皮實，重溶起來比較容易。
重溶用的是Tris 的溶液，由於這個時候樣品溶液裡面鹽濃度很高，不能直接上樣到下一步的離子交換柱上，所以需要透析。我們先把樣品放到蒸餾水中透析兩三個小時，然後再換到一般的緩衝液裡。透析大家估計都熟悉，也沒有什麼技術含量。只有兩點值得注意，首先，透析袋不能裝滿，因為透析過程中樣品體積會增加。其次，透析袋空的地方要弄癟，不能留空氣，否則樣品體積增大後，扎緊的透析袋可能會受壓而破裂。
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