上 kegg http://www.genome.jp/kegg/pathway.html
選你想看的代謝途徑
這裡舉糖解作用 http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00010.html
可以在選單中 選你想要看的物種
map上就會把該物種有的酵素 途徑 用顏色標示出來
選人類 就變這樣
http://www.genome.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=hsa&mapno=00010
2009年5月14日 星期四
濃縮protein的方法
1. 加熱或是抽乾是個方法 但無法去鹽 假使鹽過高 會造成跑的很醜
2. 如果只是要loading gel check protein, 用 centricon 太貴(約兩百到四百元)
不合乎成本
3. 用硫酸胺沉澱後透析 太花時間. 用acetone 沉澱 會loss 掉一些protein
我的解決方式 自製centricon..
把你的sample 取約 50uL 放到 eppandrof 的蓋子的凹槽
上面加個透析膜 (約1平方公分) 蓋緊
約 3000rpm 離心個數分鐘到數十分鐘 即可濃縮 又不太貴
出來後的體積約 10uL 剛好夠你跑電泳
不過操作時手要細點
2. 如果只是要loading gel check protein, 用 centricon 太貴(約兩百到四百元)
不合乎成本
3. 用硫酸胺沉澱後透析 太花時間. 用acetone 沉澱 會loss 掉一些protein
我的解決方式 自製centricon..
把你的sample 取約 50uL 放到 eppandrof 的蓋子的凹槽
上面加個透析膜 (約1平方公分) 蓋緊
約 3000rpm 離心個數分鐘到數十分鐘 即可濃縮 又不太貴
出來後的體積約 10uL 剛好夠你跑電泳
不過操作時手要細點
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labtech,
protein,
proteomics
比活性的定義
抽出液中含有的酵素活性單位:
抽出液中含有多種蛋白質，這些蛋白質中，有些則具有某些酵素活性。例如，種子抽出液
中，含有多種酵素，其中有一種即為a-amylase。抽出液中，某一種酵素含有多少量，通
常以實際的酵素活性表示，常用的單位有兩種:
(a) 以units/ml表示，即1 ml 的抽出液中含有多少unit (單位)的該種酵素活性。
(b) 以unit/mg表示，即抽出液中，每1 mg 的蛋白質含有多少unit (單位)的該種酵素活
性，此表示方法，稱為抽出液中所含有該酵素的比活性(specific activity)。對某一酵
素而言，抽出液的比活性愈高，則抽出液含有該酵素的純度愈高。
(2) 酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)
的量。受質減少(或產物增加)的量，可視實驗的需求或方便性，以莫耳(mole)、克(g)、
OD吸光值等表示。例如: 1 unit 可表示在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1
mmole; 亦可表示為在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1 mg; 或可表示為在一分鐘
內，可使受質的OD吸光值減少0.1 (或是0.01等等)。
例如:
O. D.值變化量
活性 = ------------------------
(樣品蛋白質含量) X (反應時間-分鐘)
抽出液中含有多種蛋白質，這些蛋白質中，有些則具有某些酵素活性。例如，種子抽出液
中，含有多種酵素，其中有一種即為a-amylase。抽出液中，某一種酵素含有多少量，通
常以實際的酵素活性表示，常用的單位有兩種:
(a) 以units/ml表示，即1 ml 的抽出液中含有多少unit (單位)的該種酵素活性。
(b) 以unit/mg表示，即抽出液中，每1 mg 的蛋白質含有多少unit (單位)的該種酵素活
性，此表示方法，稱為抽出液中所含有該酵素的比活性(specific activity)。對某一酵
素而言，抽出液的比活性愈高，則抽出液含有該酵素的純度愈高。
(2) 酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)
的量。受質減少(或產物增加)的量，可視實驗的需求或方便性，以莫耳(mole)、克(g)、
OD吸光值等表示。例如: 1 unit 可表示在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1
mmole; 亦可表示為在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1 mg; 或可表示為在一分鐘
內，可使受質的OD吸光值減少0.1 (或是0.01等等)。
例如:
O. D.值變化量
活性 = ------------------------
(樣品蛋白質含量) X (反應時間-分鐘)
PCR中DMSO應該加多少
每個condition都不太一樣，所以通常會從2% 4% 6% 8% 開始試
然後加DMSO會幫助primer secondary structure解開，有助於跟template 作用
然後加DMSO會幫助primer secondary structure解開，有助於跟template 作用
RT-PCR、PCR、Real time-PCR
先簡單介紹聚合鏈反應(PCR, polymerase chain reaction)吧！聚合酵素(polymerase)是負責DNA合成的酵素，在1955年發現，一開始生物學家的想法很簡單，就是模仿生物體內的反應，把模板
DNA(template)和引信(primer)加上合成DNA的原料(dNTP,核甘三磷酸)以及聚合酵素放在一起，應該就可以在一個試管內產生DNA合成的反應，這樣的方式比藉由細菌增殖質體(plasmid)內所夾帶的特定基因還要快速簡單得多，隨後1977年在溫泉中發現的ThermusAquaticus細菌中所含有的聚合酵素(俗稱Taq polymerase)，因為具有耐高溫的特性，所以能夠勝任PCR的循環(cycle)主要三步驟:變性(denaturation)、引信附著(annealing)、聚合化(polymeration)，要以少數的模板合成大量的DNA需要20至30個循環，一開始的酵素是由大腸桿菌分離的Klenow片段(fragment of Klenow)，並不耐高溫，直至Taq聚合酵素被發現後才真正造成PCR實驗的重大突破。
那麼RT-PCR又是什麼東東呢？RT指的是逆轉錄?(reverse transcriptase)，也就是把RNA
轉錄成DNA的酵素，因為一般生物原則(dogma)是DNA轉錄成RNA，再由RNA轉譯成蛋白質，
所以由RNA變成DNA便被視為一種逆向轉換，才加上reverse，RNA病毒(例如愛滋病)就是靠
著合成這樣的酵素才得以將RNA轉變成DNA。RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄
為DNA，再進行聚合?反應，這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一，因為分解RNA的酵素
(RNase)無處不在，只要溫度一升高，RNA就非常容易被分解，科學家們只好先將它轉變為
互補DNA(cDNA)，再進行聚合脢反應。
至於即時RT-PCR(real time RT-PCR)則是利用非常敏感的螢光染劑(例如Sybr Green)，當
試管內形成雙股DNA時，這個螢光染劑就會與之結合並且大放光芒，機器在每一個循環都
紀錄釋出的螢光指數，由於聚合連鎖反應會造成DNA成對數性的增加(每個循環就增加2倍
，那30個循環就會增加2的30次方倍)，螢光指數也會隨著DNA的複製(形成雙股)而增加，
科學家發現一件很有趣的事，螢光指數突然開始快速增長的某個循環(這個加速的起點是
由一個叫做threshold的值來定義)，這個循環則稱為Ct(cycle of threshold)的值與起初
cDNA的含量成反比(當然，只限於同一次PCR反應中的比較性定量)，也因為這個發現，所
以我們能夠用推測當初的RNA含量，進而研究細胞內基因表現的變化。這又要說到PCR是非
常不精確的一種反應，我們拿等量的DNA來進行同一個PCR，30個循環之後，所得到的
band(我們把反應後的產物拿去跑電泳，溴乙烷ethyl bromide染色後用放射顯影
autoradiography後呈現的條狀影像)很有可能會有不一樣的粗細程度，所以嚴格來說PCR
是不能用來定量的，然而即時聚合鏈反應則由於使用了敏感的螢光劑，所以突破了這個限
制，在嚴格的控管情形下，是可以定量細胞內基因的表現程度的。
DNA(template)和引信(primer)加上合成DNA的原料(dNTP,核甘三磷酸)以及聚合酵素放在一起，應該就可以在一個試管內產生DNA合成的反應，這樣的方式比藉由細菌增殖質體(plasmid)內所夾帶的特定基因還要快速簡單得多，隨後1977年在溫泉中發現的ThermusAquaticus細菌中所含有的聚合酵素(俗稱Taq polymerase)，因為具有耐高溫的特性，所以能夠勝任PCR的循環(cycle)主要三步驟:變性(denaturation)、引信附著(annealing)、聚合化(polymeration)，要以少數的模板合成大量的DNA需要20至30個循環，一開始的酵素是由大腸桿菌分離的Klenow片段(fragment of Klenow)，並不耐高溫，直至Taq聚合酵素被發現後才真正造成PCR實驗的重大突破。
那麼RT-PCR又是什麼東東呢？RT指的是逆轉錄?(reverse transcriptase)，也就是把RNA
轉錄成DNA的酵素，因為一般生物原則(dogma)是DNA轉錄成RNA，再由RNA轉譯成蛋白質，
所以由RNA變成DNA便被視為一種逆向轉換，才加上reverse，RNA病毒(例如愛滋病)就是靠
著合成這樣的酵素才得以將RNA轉變成DNA。RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄
為DNA，再進行聚合?反應，這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一，因為分解RNA的酵素
(RNase)無處不在，只要溫度一升高，RNA就非常容易被分解，科學家們只好先將它轉變為
互補DNA(cDNA)，再進行聚合脢反應。
至於即時RT-PCR(real time RT-PCR)則是利用非常敏感的螢光染劑(例如Sybr Green)，當
試管內形成雙股DNA時，這個螢光染劑就會與之結合並且大放光芒，機器在每一個循環都
紀錄釋出的螢光指數，由於聚合連鎖反應會造成DNA成對數性的增加(每個循環就增加2倍
，那30個循環就會增加2的30次方倍)，螢光指數也會隨著DNA的複製(形成雙股)而增加，
科學家發現一件很有趣的事，螢光指數突然開始快速增長的某個循環(這個加速的起點是
由一個叫做threshold的值來定義)，這個循環則稱為Ct(cycle of threshold)的值與起初
cDNA的含量成反比(當然，只限於同一次PCR反應中的比較性定量)，也因為這個發現，所
以我們能夠用推測當初的RNA含量，進而研究細胞內基因表現的變化。這又要說到PCR是非
常不精確的一種反應，我們拿等量的DNA來進行同一個PCR，30個循環之後，所得到的
band(我們把反應後的產物拿去跑電泳，溴乙烷ethyl bromide染色後用放射顯影
autoradiography後呈現的條狀影像)很有可能會有不一樣的粗細程度，所以嚴格來說PCR
是不能用來定量的，然而即時聚合鏈反應則由於使用了敏感的螢光劑，所以突破了這個限
制，在嚴格的控管情形下，是可以定量細胞內基因的表現程度的。
quantitative/semi-quantitative RT-PCR
絕對定量(absolute quantitation)要先用已知濃度的相同東西做出一條standard curve
(如果要測total RNA,就用已知濃度的total RNA做standard curve)
利用內插法求你的sample濃度
當然,PCR本身的一些細節條件如saturation的事情就不在這裡討論
至於半定量(semi-quantitation)則是利用一個大家都有,而且量差不多的東西
(像是house keeping gene)當作分母一樣的東西
在相同反應條件下,每一個sample都跟分母比後再做比較
你如果要問quantitative PCR,不知道是不是要問real-time quantitative PCR?
如果是的話,基本上它也分成absolute/semi quantitative
只是偵測的方式跟傳統run gel的方式不一樣,
它可以偵測到PCR的gerometric phase,這是PCR當中最符合y=2^n的時期
所以可以避開saturation的問題
(如果要測total RNA,就用已知濃度的total RNA做standard curve)
利用內插法求你的sample濃度
當然,PCR本身的一些細節條件如saturation的事情就不在這裡討論
至於半定量(semi-quantitation)則是利用一個大家都有,而且量差不多的東西
(像是house keeping gene)當作分母一樣的東西
在相同反應條件下,每一個sample都跟分母比後再做比較
你如果要問quantitative PCR,不知道是不是要問real-time quantitative PCR?
如果是的話,基本上它也分成absolute/semi quantitative
只是偵測的方式跟傳統run gel的方式不一樣,
它可以偵測到PCR的gerometric phase,這是PCR當中最符合y=2^n的時期
所以可以避開saturation的問題
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FAQ
70%酒精的效果
因為70%酒精的分子跟水的比例是1:1
且酒精本身會自己耦合成一個小球可以把水包在裡面
其實那聚成小球後，酒精的親油端會露出，親水端是包在裡面的
因此，當70%酒精跟細菌放在一起的時候
酒精的親油端會很輕鬆的「插」上細胞膜，就可以深入細胞膜把內部的蛋白質去活性了
那一定有別的問題呀！純酒精呢....
因為純的本身並不一定有一個固定的位置「插」上細胞膜
加上酒精本身濃度高滲不進去，在外面把細胞外的蛋白質去活性後
ㄟ~~~就會發現細菌多了一層硬硬的殼了！
這樣有了「裝甲」，怎麼可能那麼容易被穿過
所以就無法殺菌了
且酒精本身會自己耦合成一個小球可以把水包在裡面
其實那聚成小球後，酒精的親油端會露出，親水端是包在裡面的
因此，當70%酒精跟細菌放在一起的時候
酒精的親油端會很輕鬆的「插」上細胞膜，就可以深入細胞膜把內部的蛋白質去活性了
那一定有別的問題呀！純酒精呢....
因為純的本身並不一定有一個固定的位置「插」上細胞膜
加上酒精本身濃度高滲不進去，在外面把細胞外的蛋白質去活性後
ㄟ~~~就會發現細菌多了一層硬硬的殼了！
這樣有了「裝甲」，怎麼可能那麼容易被穿過
所以就無法殺菌了
如何寫信跟外國學者要論文?
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
TITLE: reprint request
Dear Colleague, (or Dear Prof. XXX 或 Dear Dr. XXX)
I'd appreciate a copy of the following publication:
"想跟人家要的文獻列在這裡"
If available please send pdf versions to xxx@xxx (你的e-mail address)
or paper versions to:
XXX (你的大名)
XXXXXX (你的單位)
XXXXXXXXXX (地址)
TAIWAN (建議不要寫the Republic of China；無關政治，只是很容易寄到對岸)
Thank you
XX (你的名子)
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
這樣就可以了
當然，你還可以寫一些"我對你的研究很感興趣"之類的話
不過這並非必要，除非你很想藉此認識對方
並有意進一步交流，否則不用那麼麻煩
不過1994其實有點久
作者的e-mail address很可能沒效了
最好有心理準備
TITLE: reprint request
Dear Colleague, (or Dear Prof. XXX 或 Dear Dr. XXX)
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"想跟人家要的文獻列在這裡"
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XXX (你的大名)
XXXXXX (你的單位)
XXXXXXXXXX (地址)
TAIWAN (建議不要寫the Republic of China；無關政治，只是很容易寄到對岸)
Thank you
XX (你的名子)
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
這樣就可以了
當然，你還可以寫一些"我對你的研究很感興趣"之類的話
不過這並非必要，除非你很想藉此認識對方
並有意進一步交流，否則不用那麼麻煩
不過1994其實有點久
作者的e-mail address很可能沒效了
最好有心理準備
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病毒如何保存?
病毒有那麼多種, 潛溶的, 慢的, 等等病毒不一, 這些答案都不是可以一蓋而論的.
以我知道的baculovirus來說, 在野外在陽光下,
赤裸的(as a viron)的baculovirus很快就失去活性了,
所以野生種的baculovirus需要形成polyhedra(occlusion bodies)遮蔽/保護
來存活. 等待適當時機來臨時(被吃到蟲肚裡頭pH升高時), 再打開釋出來感染.
實驗室中保存baculovirus通常是濾去細胞碎片後, 遮光在4度通常可保半年.
若放在-80C凍著可以放好幾年, 只是凍/融過程會失去不少活性.
應該不少80年代的baculovirus paper有講到. 你可以google baculovirus inactivation
或者參看baculovirus expression system manual, Clontech的或Pharmigen的都不錯.
以我知道的baculovirus來說, 在野外在陽光下,
赤裸的(as a viron)的baculovirus很快就失去活性了,
所以野生種的baculovirus需要形成polyhedra(occlusion bodies)遮蔽/保護
來存活. 等待適當時機來臨時(被吃到蟲肚裡頭pH升高時), 再打開釋出來感染.
實驗室中保存baculovirus通常是濾去細胞碎片後, 遮光在4度通常可保半年.
若放在-80C凍著可以放好幾年, 只是凍/融過程會失去不少活性.
應該不少80年代的baculovirus paper有講到. 你可以google baculovirus inactivation
或者參看baculovirus expression system manual, Clontech的或Pharmigen的都不錯.
細菌內的質體數目
事實上不會只有一個，不然的話平常我們作cloning怎會會得到那麼多plasmid呢?
再從另一個角度來看，質體有分成high-copy number及low-copy number
光從這二個名詞的存在，就可以知道細菌不可能絕對只能具有一個質體啦~
的確有的細菌的某種plasmid是只有一個，通常這種size都很大，
但是也不表示它沒有其他plasmid
plasmid有分成好多種incompatibility group
二種plasmid若是屬於同一group的成員，則只會有一種存於細菌中
所以可能會有一個細菌，同時含有五種group的plasmid，但是數目都不相等，接合時，
質體也可能會交換，像是一種稱為conjugative plasmid。
再從另一個角度來看，質體有分成high-copy number及low-copy number
光從這二個名詞的存在，就可以知道細菌不可能絕對只能具有一個質體啦~
的確有的細菌的某種plasmid是只有一個，通常這種size都很大，
但是也不表示它沒有其他plasmid
plasmid有分成好多種incompatibility group
二種plasmid若是屬於同一group的成員，則只會有一種存於細菌中
所以可能會有一個細菌，同時含有五種group的plasmid，但是數目都不相等，接合時，
質體也可能會交換，像是一種稱為conjugative plasmid。
生技實驗中有那些方法可用以破壞菌體細胞?
打破菌體的方法，主要可分兩類：
1.物理法
a.使用機械力，如研磨、壓力、超音波震盪等等
b.使用溫度變化，如液態氮或負70度C冷凍使菌體內的水因此
變成固態結晶，而破壞其細胞膜等結構，
待解凍後就會使該部分產生孔洞。
2.化學法
a.利用鹽濃度不同導致滲透壓差異，使細菌漲破。
b.使用藥劑或酵素分解其細胞膜
吾人常用的solution I、II系列即綜合使用上述觀念，另外
某Q牌kit教人在其lysis buffer中加入lysozyme也是這個原因。
c.利用熱使細胞膜破裂，算是既有物理法也有化學法，一方面
使用熱使細胞澎漲同時脂質流動性增高進而導致細胞瓦解，
另一方面，熱使得細胞膜上的蛋白質等變性而失去功能等。
1.物理法
a.使用機械力，如研磨、壓力、超音波震盪等等
b.使用溫度變化，如液態氮或負70度C冷凍使菌體內的水因此
變成固態結晶，而破壞其細胞膜等結構，
待解凍後就會使該部分產生孔洞。
2.化學法
a.利用鹽濃度不同導致滲透壓差異，使細菌漲破。
b.使用藥劑或酵素分解其細胞膜
吾人常用的solution I、II系列即綜合使用上述觀念，另外
某Q牌kit教人在其lysis buffer中加入lysozyme也是這個原因。
c.利用熱使細胞膜破裂，算是既有物理法也有化學法，一方面
使用熱使細胞澎漲同時脂質流動性增高進而導致細胞瓦解，
另一方面，熱使得細胞膜上的蛋白質等變性而失去功能等。
degenerate primer
Degenerate nucleotide codes:
R=AG, Y=CT, M=AC, K=GT, W=AT, S=CG, B=CGT,
D=AGT, H=ACT, V=ACG, N=ACGT
R=AG, Y=CT, M=AC, K=GT, W=AT, S=CG, B=CGT,
D=AGT, H=ACT, V=ACG, N=ACGT
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FAQ
DNA在純水中能維持雙股嗎?
維持雙股要靠鹼基形成的氫鍵
在純水中並不會造成氫鍵的分開
重要的是"溫度"
溫度造成的分子擾動動能大於氫鍵鍵結力時
雙股就難以維持了
純水中水分子對DNA形成氫鍵的機會會大於含鹽類的水溶液
水分子對DNA形成的氫鍵會干擾DNA雙股間的鍵結力
所以在相同的擾動動能(溫度)情況下
水中的鹽類分子確實能幫助DNA雙股的穩定
但這不代表DNA在純水中無法形成雙股
溫度的影響通常會比鹽類的影響還要大的多
在純水中並不會造成氫鍵的分開
重要的是"溫度"
溫度造成的分子擾動動能大於氫鍵鍵結力時
雙股就難以維持了
純水中水分子對DNA形成氫鍵的機會會大於含鹽類的水溶液
水分子對DNA形成的氫鍵會干擾DNA雙股間的鍵結力
所以在相同的擾動動能(溫度)情況下
水中的鹽類分子確實能幫助DNA雙股的穩定
但這不代表DNA在純水中無法形成雙股
溫度的影響通常會比鹽類的影響還要大的多
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FAQ
TA cloning
2X Rapid ligation buffer(使用前先Vortex) 5μl
PGEM-T Vector 1μl
PCR product 2μl
T4 ligase 1μl
D.D H2O 1μl(與PCR product合起來3μl即可)
-----------------------------------------------------------
10μl
1.TA Sample 10μl+100μl comptent cells
↓ on ice 30 min
↓ 42℃ 2min
↓ on ice 2 min
2.加入400μl LB Medium
↓ 37℃ 1 Hr
3.加入75μl IPTG + 75μl X-gal
↓ Mix cell
4.塗plate (Sample 名、日期),1盤200μl
5.37℃ overnight (不可超過16Hrs)
------------------------------------------
挑藍白菌
1.取新plate，分20格。
2.將菌挑到新plate中，用滅菌棒劃菌。(藍菌挑兩個當Control)
3.37℃ overnight
4.用木棒挑一半Clony 插入eppendoff內，靜置15分鐘，攪拌。
(eppendoff要先加Lysis buffer，100μl/eppdoff)
(剩下的冰冰箱(4℃)，之後可抽質體)
5.攪拌成黏稠狀，丟棄木棒。
6.每管90μl phenol-chrolform mix well 離心12000 rpm,5 min
7.抽上層DNA 取8μl run gel(100volt 30 min)
Marker使用1kb，plasmid 為4kb圓型會run到2 kb的位置。
PGEM-T Vector 1μl
PCR product 2μl
T4 ligase 1μl
D.D H2O 1μl(與PCR product合起來3μl即可)
-----------------------------------------------------------
10μl
1.TA Sample 10μl+100μl comptent cells
↓ on ice 30 min
↓ 42℃ 2min
↓ on ice 2 min
2.加入400μl LB Medium
↓ 37℃ 1 Hr
3.加入75μl IPTG + 75μl X-gal
↓ Mix cell
4.塗plate (Sample 名、日期),1盤200μl
5.37℃ overnight (不可超過16Hrs)
------------------------------------------
挑藍白菌
1.取新plate，分20格。
2.將菌挑到新plate中，用滅菌棒劃菌。(藍菌挑兩個當Control)
3.37℃ overnight
4.用木棒挑一半Clony 插入eppendoff內，靜置15分鐘，攪拌。
(eppendoff要先加Lysis buffer，100μl/eppdoff)
(剩下的冰冰箱(4℃)，之後可抽質體)
5.攪拌成黏稠狀，丟棄木棒。
6.每管90μl phenol-chrolform mix well 離心12000 rpm,5 min
7.抽上層DNA 取8μl run gel(100volt 30 min)
Marker使用1kb，plasmid 為4kb圓型會run到2 kb的位置。
製作Competent cells
全程On ice
1.Stock cells 由-20(-80)℃解凍取20λ+20 ml LB (1%) ->37℃ overnight
取1%(200λ+20ml LB) -> refresh 2hr 37℃。
2.離心 8000 rpm,4℃,5min 去上清液 (flow 內執行)。
1~2 min
加CaCl2(100mM)10ml(1/2菌液量) 彈一彈打散----->離心5000rpm,5min,4℃
3.去上清液->加CaCl2 100mM with glycerol 3ml 打散 -->分裝300λ/eppendorf 約十管
於-20(-80)℃保存。
1.Stock cells 由-20(-80)℃解凍取20λ+20 ml LB (1%) ->37℃ overnight
取1%(200λ+20ml LB) -> refresh 2hr 37℃。
2.離心 8000 rpm,4℃,5min 去上清液 (flow 內執行)。
1~2 min
加CaCl2(100mM)10ml(1/2菌液量) 彈一彈打散----->離心5000rpm,5min,4℃
3.去上清液->加CaCl2 100mM with glycerol 3ml 打散 -->分裝300λ/eppendorf 約十管
於-20(-80)℃保存。
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E. Coli
HI test HA test
1.血球凝集反應之測定（Hemagglutination test, HA test）：用來測定雞隻對綿羊紅血
球所產生之免疫反應抗體力價。依據林等（1996）方法所述，其測定步驟簡述如下：
取待檢血清 0.025 ml 於 96 孔 U 型盤中以生理食鹽水做 2 倍連續稀釋後，滴
入1% 之綿羊紅血球懸浮液 0.025 ml 於 U 型盤每一孔中，振盪使混合均勻並靜置
2小時後，記錄產生凝集現象之最高稀釋濃度，取 log2 值即為該血清之抗體力價。
2.血球凝集抑制試驗（Hemagglutination inhibition test, HI test）：用來
測定雞隻對新城雞瘟疫苗所產生的免疫反應抗体力價。依據林等（1996）方法所述，
其測定步驟簡述如下：
取待測血清 0.025 ml，於 96 孔 U 型盤中以生理食鹽水做 2 倍連續稀釋後，每孔
加入 0.025 ml 8 單位之抗原稀釋液（省衛生試驗所製造），振盪使混合靜置 15 分鐘
後，每孔加入 1% 紅血球懸浮液 0.05 ml，靜置 1 小時後判定，如能完全抑制紅血球
凝集則判定為 "＋"，此稀釋濃度取 log2 值即為血清之力價。
球所產生之免疫反應抗體力價。依據林等（1996）方法所述，其測定步驟簡述如下：
取待檢血清 0.025 ml 於 96 孔 U 型盤中以生理食鹽水做 2 倍連續稀釋後，滴
入1% 之綿羊紅血球懸浮液 0.025 ml 於 U 型盤每一孔中，振盪使混合均勻並靜置
2小時後，記錄產生凝集現象之最高稀釋濃度，取 log2 值即為該血清之抗體力價。
2.血球凝集抑制試驗（Hemagglutination inhibition test, HI test）：用來
測定雞隻對新城雞瘟疫苗所產生的免疫反應抗体力價。依據林等（1996）方法所述，
其測定步驟簡述如下：
取待測血清 0.025 ml，於 96 孔 U 型盤中以生理食鹽水做 2 倍連續稀釋後，每孔
加入 0.025 ml 8 單位之抗原稀釋液（省衛生試驗所製造），振盪使混合靜置 15 分鐘
後，每孔加入 1% 紅血球懸浮液 0.05 ml，靜置 1 小時後判定，如能完全抑制紅血球
凝集則判定為 "＋"，此稀釋濃度取 log2 值即為血清之力價。
ELISA 血清分析
1. 將100μl/well antibody coated入 HB plate中央60 wells內。蓋上蓋子，
以溼紙巾包裹，置入夾鏈袋中，於37℃ 1hr/4℃ overnight/RT 2hr。
ps:使用PBS or Coating buffer將血清以1:200~1:3200、4G2抗體以1:1000 稀釋
2.使用PBST buffer 洗五次。
3.使用300μl Block Buffer 固定well，立即移除溶液。
4.乾燥plate
5.加入100μl/well 百倍稀釋的antigen，於4℃ overnight
-----------------------------隔天------------------
1.使用PBST洗五次
2.加入100μl/well 1:1000 6B6C-1-HRP 溶於5%牛奶中
3.加入100μl/well 1:100/200/400/800/1600 ANTI-JEV SERUM，於37℃ 1hr
4.洗plate(1,2) 10次，加入100μl/well substrate，室溫反應十分鐘後，加入50μl
2N H2SO4停止反應。
5.洗plate(3) 5次，加入1:1000稀釋(in 5% milk)的IgG HRP-conjugate，於37℃ 1hr
6.洗plate(3) 10次，加入100μl/well substrate，室溫反應十分鐘後，加入50μl
2N H2SO4停止反應。
以溼紙巾包裹，置入夾鏈袋中，於37℃ 1hr/4℃ overnight/RT 2hr。
ps:使用PBS or Coating buffer將血清以1:200~1:3200、4G2抗體以1:1000 稀釋
2.使用PBST buffer 洗五次。
3.使用300μl Block Buffer 固定well，立即移除溶液。
4.乾燥plate
5.加入100μl/well 百倍稀釋的antigen，於4℃ overnight
-----------------------------隔天------------------
1.使用PBST洗五次
2.加入100μl/well 1:1000 6B6C-1-HRP 溶於5%牛奶中
3.加入100μl/well 1:100/200/400/800/1600 ANTI-JEV SERUM，於37℃ 1hr
4.洗plate(1,2) 10次，加入100μl/well substrate，室溫反應十分鐘後，加入50μl
2N H2SO4停止反應。
5.洗plate(3) 5次，加入1:1000稀釋(in 5% milk)的IgG HRP-conjugate，於37℃ 1hr
6.洗plate(3) 10次，加入100μl/well substrate，室溫反應十分鐘後，加入50μl
2N H2SO4停止反應。
明欣定序流程
E-mail一定要填!!(結果會寄到e-mail)
產物代號、預期大小、Primer濃度
附照片(產物跑膠出來的照片，以利比對。)
附Primer。
用夾鏈帶封裝 產物、Primer(都要用石蠟封口)、照片
之後打電話叫人來取。(primer用小夾鏈袋另外分裝比較好)
定序Plasmid的要求濃度 50ng/ml 15ul
Primer(10uM) 5ul
每一條DNA都需要5ul的primer，要算好。
產物代號、預期大小、Primer濃度
附照片(產物跑膠出來的照片，以利比對。)
附Primer。
用夾鏈帶封裝 產物、Primer(都要用石蠟封口)、照片
之後打電話叫人來取。(primer用小夾鏈袋另外分裝比較好)
定序Plasmid的要求濃度 50ng/ml 15ul
Primer(10uM) 5ul
每一條DNA都需要5ul的primer，要算好。
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labtech,
sequencing
甲基纖維素配法
1.將水加熱至100℃，關加熱器，讓水稍冷。
2.加入甲基纖維素(配成2.2%)，以stir bar 攪拌overnight
3.autoclave
4.加入等量Medium(配成5%血清)，如養BHK21，則加入MEM。
2.加入甲基纖維素(配成2.2%)，以stir bar 攪拌overnight
3.autoclave
4.加入等量Medium(配成5%血清)，如養BHK21，則加入MEM。
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cell culture
[配藥] 各種Medium
MEM
FCS 100ml/1L
Medium E A A 1包/1L
NaHCO3 2.2g/1L
Antibody 4ml/1L
d.d.w 加至1L
(確認Powder包內容物，是否有含NEAA)
F12 F12配方的NaHCO3改為1.16/1L
C6/36 MEM再加HEPES 2g/1L
FCS 100ml/1L
Medium E A A 1包/1L
NaHCO3 2.2g/1L
Antibody 4ml/1L
d.d.w 加至1L
(確認Powder包內容物，是否有含NEAA)
F12 F12配方的NaHCO3改為1.16/1L
C6/36 MEM再加HEPES 2g/1L
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cell culture
Plaque assay 病毒斑測試
1.將BHK21稀釋成4x10(四次方)個細胞/ml，取4ml/well種入6孔培養盤，
約一天半可形成單層細胞。BHK21要留一點在Flask內繼續養。
2.以48孔培養盤進行病毒液稀釋，以十倍稀釋病毒液6~8次(50μl病毒液溶於450μl內。)
3.倒除預先準備好的六孔培養盤中的培養液，並加入200μl的病毒稀釋液，放置於37℃，
Co2培養箱內感染一小時，感染期間每20分鐘搖晃一次，不可讓細胞乾掉，使病毒液均
勻覆蓋及感染。
4.感染一小時候，吸除六孔培養盤內的病毒液，加入4ml/well甲基纖維素培養液(0.5L
2.2% methylcellulose (Sigma,USA)，5% FCS，50% MEM)
5.培養至出現病毒斑後(通常日本腦炎約3～4天、登革病毒約六～七天)，以10%福馬林-酒
精溶液(Wako,Japan)固定(1 ml/well)一小時。
6.倒掉六孔培養盤內的液體，加入0.5%結晶紫(crystal violet)進行細胞染色(1ml/well)
可以均勻分布即可，染色時間六小時(overnight)。
7.自來水清洗，計算病毒斑數量。
約一天半可形成單層細胞。BHK21要留一點在Flask內繼續養。
2.以48孔培養盤進行病毒液稀釋，以十倍稀釋病毒液6~8次(50μl病毒液溶於450μl內。)
3.倒除預先準備好的六孔培養盤中的培養液，並加入200μl的病毒稀釋液，放置於37℃，
Co2培養箱內感染一小時，感染期間每20分鐘搖晃一次，不可讓細胞乾掉，使病毒液均
勻覆蓋及感染。
4.感染一小時候，吸除六孔培養盤內的病毒液，加入4ml/well甲基纖維素培養液(0.5L
2.2% methylcellulose (Sigma,USA)，5% FCS，50% MEM)
5.培養至出現病毒斑後(通常日本腦炎約3～4天、登革病毒約六～七天)，以10%福馬林-酒
精溶液(Wako,Japan)固定(1 ml/well)一小時。
6.倒掉六孔培養盤內的液體，加入0.5%結晶紫(crystal violet)進行細胞染色(1ml/well)
可以均勻分布即可，染色時間六小時(overnight)。
7.自來水清洗，計算病毒斑數量。
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cell culture
SDS-PAGE 的定量
1.photoshop 可以用來定量，跑完膠掃描後藉由分析圖片
跟Marker band 的深淺比對知道蛋白質的量。
2.有paper使用image J來對照顏色
3.這種定量法不精確，只能參考用。
跟Marker band 的深淺比對知道蛋白質的量。
2.有paper使用image J來對照顏色
3.這種定量法不精確，只能參考用。
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proteomics
如何解開蛋白質三級結構?
最簡單先在NCBI網頁的STRUCTURE查此蛋白三級結構是否已被解出?如果沒有，但有相近的蛋白已被解過，就可以到http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html
左上方有個Modeling requests，點First Approach mode，再來就輸入自己的E-mail跟想預測的蛋白序列就可以了。
大概過了半天(4~8小時)就會寄個pdb file過來，他的原理是和已知結構的sequence做local比對,若相似就會有相同的folding方法，算是用cluster的方法，有些protein會預測的蠻準的。
但還是modeller的預測會好一些,因為他是利用給的sequence和已知結構的sequence做global比對,相似度高的再做類似的folding,所以會預測的準一些,只是缺點就是若你要的protein結構在database裡沒有相似的就比較容易預測失敗~
如果再不行
只好利用X-ray或NMR解了。
左上方有個Modeling requests，點First Approach mode，再來就輸入自己的E-mail跟想預測的蛋白序列就可以了。
大概過了半天(4~8小時)就會寄個pdb file過來，他的原理是和已知結構的sequence做local比對,若相似就會有相同的folding方法，算是用cluster的方法，有些protein會預測的蠻準的。
但還是modeller的預測會好一些,因為他是利用給的sequence和已知結構的sequence做global比對,相似度高的再做類似的folding,所以會預測的準一些,只是缺點就是若你要的protein結構在database裡沒有相似的就比較容易預測失敗~
如果再不行
只好利用X-ray或NMR解了。
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實用網站,
proteomics
預測電泳圖的網站
Biology Workbench:
http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi
要先註冊(很簡單), 然後進入"nucleic tools"
先"add new sequence"把你的序列存進去
然後選tool中的(TAGC), 基本上跟限制脢有關的資訊都會有了, 算是詳盡.
http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi
要先註冊(很簡單), 然後進入"nucleic tools"
先"add new sequence"把你的序列存進去
然後選tool中的(TAGC), 基本上跟限制脢有關的資訊都會有了, 算是詳盡.
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實用網站,
genomics,
proteomics
如何寄 Plasmid 到國外?
1.抽 mini 的 Plasmid 濃度就足夠，溶出後做一次retransformation濃度絕對綽綽有餘
2.3M paper 不需要什麼前置處理，乾淨就好
3.大概剪1.5~2公分見方的3M paper，劃上約1cm直徑的圓，再把DNA乾在圈圈裡，再用塑膠膜封口，或一般封口袋也可。
4.一次吸20~50ul，直接滴在 3M paper 上，一下就暈乾了。
5.室溫包裹或是一般平信即可
2.3M paper 不需要什麼前置處理，乾淨就好
3.大概剪1.5~2公分見方的3M paper，劃上約1cm直徑的圓，再把DNA乾在圈圈裡，再用塑膠膜封口，或一般封口袋也可。
4.一次吸20~50ul，直接滴在 3M paper 上，一下就暈乾了。
5.室溫包裹或是一般平信即可
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