作者已不可考，如有人知道請告知
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（十九）MDA-BF-1的啟示
凝集素層析實際操作起來很簡單，跟過簡單的Ni 柱子一樣。拿到洗脫的蛋白之後，我們就著手開始測活，分析純化的效率和倍數。胰島素受體不是酶，所以測活是利用胰島素與受體的特異結合。具體的測活步驟非常簡單，就是把I-125 標記的胰島素和純化的組分混合然後孵育一段時間。然後加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000 沉澱胰島素受體，而游離的胰島素不會被沉澱下來。說到PEG 沉澱，Dr.Lin 講了她自己鬧的一個笑話。是這樣的，她實驗室發現了一個蛋白質因子 MDA-BF-1。這個因子對Osteoblast（成骨細胞）的增長有促進作用。然後呢，她就想把這個因子的受體給找出來。首先一步呢，就是得有一個測活方法。
所以她就比照insulin receptor 的測活方法而設計了一個方法, 其中連PEG 沉澱都是一樣的。結果呢，這個測活試驗完全失敗了。問題出在PEG 沉澱這一步。PEG 作為一種多元醇，可以想像為一種“分子海綿”，可以吸附水分子。這樣樣品中蛋白的有效濃度實際變大了好多，容易出現聚集然後沉澱的現像。這就是為什麼insuline receptor 可以被沉澱下來的原因。而游離的胰島素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉澱不下來。而Dr. Lin 發現的MDA-BF-1 因子，分子量相對insulin 大了好多，有50 多KD，所以游離的因子也能被PEG 沉澱下來。聽完這個小插曲，我感覺挺吃驚，作為一個有經驗的教授，Dr.Lin 在沒弄清楚原理的情況下竟然就胡亂套用protocol 。所以呢，我感覺做實驗，僅僅是follow protocol 把實驗完成了，是遠遠不夠的。一定得搞清楚原理是怎麼回事，這樣出了問題才知道怎麼去改進。
MDA-BF-1 不僅僅給我以上的啟示。Dr.Lin 給我們做了一個seminar， 講述她的研究進展。其中她重點談到了MDA-BF-1 這個因子。 她實驗室現在正在做的是試圖用蛋白質純化的辦法來找出MDA-BF-1 的受體。她的測活方法是這樣的，首先表達MDA-BF1 的重組蛋白，然後用同位素標記，然後做binding assay。這個binding assay 很麻煩，因為沒辦法用簡單的手段把游離的MDA-BF-1 和與受體結合上的MDA-BF-1 分開，只能用gel filtration column 來分開，每做一次assay 都很麻煩。雖然Dr.Lin 提到她們還沒有找到那個受體，我個人覺得這個方法不是很明智。為什麼呢?純化蛋白的過程中，各種膜蛋白都處於一種被去垢劑溶解的勻漿狀態，這種情況下，一些正常生理條件下不會與MDA-BF1 結合的受體可能也會與其結合。 這樣一來，純化出來的東西就是亂七八糟的了。另外一種可能性是: 有很多膜蛋白能與MDA-BF-1 相互作用， 但是只有一種膜蛋白能夠啟動下游的信號傳導，促進Osteoblast 的增長。這種binding assay 的測活方法雖然可以找出與MDA-BF-1 結合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本沒有信號傳導的功能。需要強調的是，蛋白質純化絕對不是萬能的。要想純化出一個未知蛋白，最最重要的是要有一個簡單明了直接的測活方法。
Dr.Lin 實驗的問題，說到底，就是沒有好的測活方法。
這一個模塊的純化試驗到此就為止了。我們測活之後，比較了各種去垢劑的純化效率，發現Triton , CHAPS, Octyl Glucoside 都還比較好，Sodium Cholate 則差好多。原始的實驗手冊上還有進一步的insulin affinity chromatography 和其他分析。而教員為了滿足很多學生做做重組蛋白表達純化的願望，用一些比較白痴的的實驗取代了原有很經典的實驗。比如一個實驗是從SF9 裡面純化一個his tag 的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做這個試驗之後，幾乎要抓狂了。我這一組其他幾個人還把這個試驗當寶，搶著做。而我最後選擇去跑了一個2D gel。就這樣，第三個模塊的實驗結束了。
（二十）鈣調蛋白
純化胰島素受體的模塊結束之後，我們這一組人進入到最後一個模塊，做鈣調蛋白的純化和分析。鈣調蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細胞裡面都能找到。這個蛋白只有148 個氨基酸，大概16KD，比較小。有Ca2+結合的情況下，鈣調蛋白的構像可以發生較大的改變，從而激活一系列酶的活性，比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些protein kinases, phosphatases 和ATPase 等等。這一個模塊的實驗中，我們是從雞胗裡面提取和純化鈣調蛋白，然後再做一些分析。
這一個模塊的純化設計，可以說是最大限度的利用了鈣調蛋白的特殊性質，我覺得設計的很精彩。不過我對這個模塊的實驗經歷並不是很滿意。教員的實驗助手只有一個人，而且非常不稱職，對實驗本身似乎不太了解，也不是很helpful，感覺比前幾個模塊的實驗助手差多了。教員叫Constantin，是一個俄羅斯人，在rutgers 當教授。我起初對他印像不佳，後來發現這個人其實很nice,非常和藹。整個純化步驟大概是這樣的。首先把雞胗剁碎勻漿，然後做粗分離，用硫酸銨沉澱的辦法把雜蛋白都沉澱下來。然後再做等電點沉澱，把Calmodulin 沉澱下來。重溶沉澱之後再做透析來脫鹽。然後再過陰離子交換柱DEAE Sephadex A-50。純化出來的組分再過疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin 了，用Commassie blue 都可以染出來。我們做的實驗中沒有對Calmodulin 的測活實驗，可能是因為最後純化出來的Calmodulin很多,可以做光譜分析之類的實驗進行分析，所以就省掉了。但我多少有一點本末倒置的感覺。因為對未知蛋白質純化，首先就得有一個靠的住的測活方法, 然後才能逐漸制定最優化的純化策略。另外，在設計測活方法之前，還必須搞清楚，有生物活性的物質是不是蛋白質。
一般有下列幾種方法。(1)對protease 的是否敏感。(2)生物活性不會因為透析而丟掉(3)Urea之類的變性劑是否降低生物活性(4)對化學修飾劑(比如sulfur hydryl blocker idoacetamide)是
否敏感。
我們提取鈣調蛋白所用的組織原料，雞胗，量挺大的，有一斤之多，紅紅的一大堆肉。這樣的組織，勻漿是一件很麻煩的事情，所以我們用了一個大號的勻漿機，試圖把肉都搗爛。但是效果不好，重復了兩次，還是有很多肉沒有被弄碎，所以只好扔掉了。值得強調的是，對於這樣大量組織的勻漿，緩衝液的配方必須有所考慮。首先，離子強度要低一點，高離子強度容易導致蛋白質聚集和沉澱；其次，最好加如EDTA 之類金屬離子螯合劑。這是因為組織裡面會有很多二價陽離子，有可能會與組織裡面的一些無機鹽（比如磷酸鹽）反應產生沉澱，導致勻漿中蛋白質不能完全溶解。最後，如果要在後續步驟中過陽離子交換柱，要避免有primary amine 的緩衝物（比如tris），如果要過陰離子交換柱，則要避免用磷酸buffer。我們拿到勻漿之後，然後過濾。接著的一步就是硫酸銨沉澱。硫酸銨沉澱的原理我前面提到過，所以就不多說了。我們用了飽和硫酸銨濃度（６０％）來沉澱。鈣調蛋白這個東東很奇怪，沒有鈣離子結合的情況下很親水，所以即使用飽和硫酸銨，也沉澱不下來。但大量的雜蛋白都能被沉澱下來。當然也不是所有的雜蛋白，至少血紅蛋白就不行，因為硫酸銨沉澱後的上清還是紅色的。下一步呢，就是等電點沉澱。鈣調蛋白是一個很酸的蛋白，等電點只有4.05，所以可以加硫酸使pH 降到4.05 附近，蛋白總電荷為零，就容易聚集沉澱。我的感覺是，等電點沉澱並不是很可靠的方法，因為很難保證沉澱過程中蛋白會不會變性。搞不好，蛋白沉澱後就沒法重溶了。鈣調蛋白溶解性比較好，也比較皮實，重溶起來比較容易。
重溶用的是Tris 的溶液，由於這個時候樣品溶液裡面鹽濃度很高，不能直接上樣到下一步的離子交換柱上，所以需要透析。我們先把樣品放到蒸餾水中透析兩三個小時，然後再換到一般的緩衝液裡。透析大家估計都熟悉，也沒有什麼技術含量。只有兩點值得注意，首先，透析袋不能裝滿，因為透析過程中樣品體積會增加。其次，透析袋空的地方要弄癟，不能留空氣，否則樣品體積增大後，扎緊的透析袋可能會受壓而破裂。
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