從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-12

作者已不可考，如有人知道請告知
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（二十三）正相與反相
我們純化出鈣調蛋白之後，就開始進行一些蛋白質化學的分析。主要是蛋白酶消化，反相HPLC 分析，MALDI-TOF 質譜之類的分析。我覺得在這個課程裡面加一個質譜分析並不是那麼有用，因為基本上只是演示實驗，只是講了講皮毛而已。相比之下反相HPLC 在蛋白質純化中要重要得多。HPLC 的全稱是High Performance Liquid Chromatography （高效液相色譜），這個名稱聽起來好像很尖端的樣子，其實HPLC 組成部件非常簡單，主要是三部分，泵，柱子，和UV monitor。反相HPLC 跟一般的色譜的一個顯著不同是壓力。為了保證純化蛋白的分辨能力，反相HPLC 柱的matrix 材料顆粒非常精細，所以必須施加很大的壓力才能跑得動柱子。相比之下，反相HPLC 所需壓力比一般gel filration 柱子壓力大十倍都不止。反相HPLC 的分辨度十分驚人，遠遠超過其他色譜方法。分辨度高到什麼地步呢，我舉一個自己的例子。我原來在E.Coli 裡面表達EGF repeat，大概有7 到8KD 的樣子，然後用體外反應加上一個fucose 糖基。這個fucose 分子量只有146。就這麼小的區別，即使跑在SDS-PAGE 上也是看不出來的，但是用反相HPLC 可以很完全的把沒有糖基和修飾上糖基的EGF repeats 分成兩個峰。可見反相HPLC 有多麼強大了。

反相HPLC 雖然很強大，但是它最大的弱點是不能用來分離大的蛋白，只能用來分離小肽或者小蛋白（比如histone）。具體說起來，大於30KD 的蛋白就可能不行了。原因是洗脫相裡面用得是有機溶劑，容易使大蛋白，尤其是帶有很多二級結構的蛋白變性。

反相HPLC 為什麼叫反相(reverse phase)呢? 這其實跟正相(normal phase) HPLC 有關係。
正相HPLC 依靠提高流動相的極性來洗脫。而反相HPLC 則相反，依靠降低流動相的極性來洗脫。正相和反相HPLC 柱子的材料都是由silica gel（硅膠）構成的。反相HPLC 柱子的silica gel 上面還有衍生的alkyl group，所以疏水性強了許多。正相HPLC 一般用來分離脂類分子。脂類分子有少許極性，如果樣品溶解在有機溶劑裡面，再過柱的話，可以與柱子的silica gel 結合上。如果在流動相裡面逐漸提高極性成分，脂分子就會被洗脫下來。反相HPLC則是用來分離蛋白質的。蛋白質有部分疏水性質，過反相柱的時候，可以與silica gel 上的alkyl group 相互結合。但是如果在流動相裡面逐漸提高非極性成分（比如acetonitrile），蛋白質就會被洗脫下來。

大家可能注意到，反相HPLC 的原理和疏水作用層析的原理很相似。但是，反相HPLC裡面的蛋白質與柱子的疏水作用比一般疏水作用層析要強得多。原因就在於反相HPLC 流動相中含有TFA（三氟乙酸）。TFA 是一種強酸，所以能很有力質子化蛋白質中的羧基，是之不帶負電。同時又能與蛋白質中正電基團形成離子對，進一步增加蛋白質與柱材料的疏水相互作用。
反相HPLC 具體跑起來很簡單，主要是操作儀器，先把蛋白質樣品和0.1%TFA 的溶液混合一下，然後上樣，用0.1%TFA 衝洗若干分鐘，使得蛋白樣品和柱子結合上。然後逐漸增加流動相中的acetonitrle（乙晴）濃度，洗脫蛋白。

（二十四）尾聲
蛋白質純化第十三天，也就是最後一天的時候，大家基本上都鬆弛了下來，開始準備狂歡。先是每人發了一件紀念T shirt，然後在CSHL 的酒吧裡面開酒會，再接著就是龍蝦宴。
不過氣氛最熱烈的還是龍蝦宴之後的詩會。詩會我還是第一次碰到，要求每人寫一首跟蛋白質純化有關的詩，並且當眾朗讀，場面十分熱鬧和搞笑。我好不容易寫了一首，是這樣的：
My protein
My protein used to be wild,
Like a naughty child,
He likes to play seek and hide,
which makes me feel really tired,
But now I can find him no matter it is day or night,
Because from ***, Al, Sue-hwa and Constantin,
I have learned how to Purify!
詩會之後，絕大部分同學和老師都在活動室打乒乓球或者台球。而我由於住得近，就直接開車回學校了。回想起來，這一次的課程十分令人難忘，認識了很多新朋友，學到了很多新知識，大大開闊了眼界。當然，指望在短短的兩個星期就學會所有蛋白質純化的技術是很不現實的，但是這個課程至少讓我們認識到，蛋白質純化雖然很復雜，但是本身並不是那麼高不可攀。只要用心去揣摩和嘗試，就一定可以做得很好。

除了13 天的課程，寫這一系列學習筆記，也讓我收獲不小。因為寫的過程中，我認真的複習了所做實驗的記錄和課程的教材，對實驗設計的理解加深了好多。這也算是除了在BBS 上灌水外的一個意外收獲吧。
最後，如果有同學對蛋白質純化十分感興趣，我在此推薦兩本參考書。一本是我們這個課程的教材 Strategies for protein purification and characterization: a laboratory course manual .
Cold Spring Harbor laboratory Press。另一本是Methods in Enzymology. Vol 182, Guide to
Protein purification Academic Press.