作者已不可考，如有人知道請告知
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（十三）裝柱子的學問
上篇提到了Gel filtration 的基本原理，現在談談我裝柱子的過程。我們用的是Amersham的 XK26/40 的空柱子，然後往裡面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理說，要提高分辨率，柱子應該是越長越細才好，這種柱子雖然不短，但是挺粗的。但是一個好處就是，樣品體積可以大一些。
裝柱子本身就是一件很tricky 的事情，以致於這課的教程上專門列了一小節來解釋怎麼裝柱子。我們這一組人中，我負責裝柱子。一開始就是洗resin 了，用粗制燒結玻板過濾的漏斗來洗，感覺這方法還挺快的。洗完了，就把resin 重懸成50%的slurry，然後就是往柱子裡頭倒了。但是呢，有一個小竅門，就是必須先封閉柱子的下出口，往柱子裡面倒10%體積的buffer。我過去裝柱子犯傻，不知道要這麼做，結果發現下面的resin 不均勻不說，還有一大堆氣泡。所以先加buffer 是很必要的。倒slurry 的時候還得用玻棒引流，這樣可以儘可能的避免氣泡。然後就是等了，等resin 沉降３０分鐘後，就可以打開柱子的下出液口，讓多餘的緩衝液流出去。液面低到靠近柱面的時候呢，就可以把上端液流接頭接到柱子上方。
這個過程最麻煩了，主要是不能引入氣泡，所以先得讓這個接頭裝置裡面充滿緩衝液，把氣泡趕出來。我第一次做沒經驗，費了九牛二虎之力才搞定了。然後就是接上蠕動泵(peristaltic pump) 加壓，讓resin 繼續緊縮一下。隨著柱面的下降，接頭裝置還得不斷往下移動，使得接頭剛剛好與柱面接觸。接觸不緊密的話，等於是衝淡了樣品，分辨率會降低。
柱子裝好了，但還不能開始跑樣品。為什麼呢？因為這種柱子的質量必須很好才能達到分離蛋白的效果，否則是根本沒法work 的。所以呢，首先得測試這個柱子是否真的裝好了。測試過程很簡單，就是跑一下藍色葡聚糖(blue dextran)，藍色葡聚糖是帶有藍色染料的多糖高分子聚合體，體積非常大，所以在空體積(void volume)就會洗脫出來。跑藍色葡聚糖可以達到三個目的。第一個就是確定void volume，知道這個空體積是很重要的。因為每次裝柱子，實際resin 的總體積都會有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脫體積與空體積的比值是一定的，所以只要知道了空體積，就能知道蛋白大概會在什麼時候洗脫出來。第二個就是確定樣品會被稀釋多少。第三個呢，是柱子是否裝的均勻。如果裝的不均勻，葡聚糖就會跑得形狀怪異。一般來說呢，柱子下端堆積會比上端均勻，為了分辨度好，應該從更均勻的一端上樣。所以我們在做的時候，是從下端上樣的。忙活了半天，當所有裝置都裝好的時候，感覺還是挺興奮的。首先是蠕動泵，然後是柱子，然後是UV monitor 加記錄儀。整套裝置不貴，功能卻很齊全。
（十四）anfinsen的疑慮
跑完sephacryl 柱子，組分就可以過DNA affinity column。DNA affinity column 雖然很重要，但是這一步技術上來說要求很低。買來CNBR 活化好的agarose，然後讓特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最簡單便宜的一次性柱子。親合層析是目前最常用也最強大的一種蛋白質純化技術, 純化效率比別的層析方法可以高出一兩個數量級。這種方法誕生是六十年代的事情。當時是在NIH 的Anfinsen 實驗室。
Anfinsen 是一個諾貝爾獎獲得者，可以說是蛋白質折疊研究的老祖宗。他主要貢獻是通過研究ribonuclease 的變性和重折疊證明氨基酸序列就可以決定蛋白質最後的三維結構。他實驗室那時侯有一個學生一個project 是從葡萄球菌裡面提取大量核酸酶，然後研究enzyme/inhibitor interaction。這個純化可是很麻煩的事情，用gel filtration, ionexchange,hydrophobic interaction, 效率都很低。有人可能會問，怎麼不在E.Coli 表達his-tag 重組蛋白，然後用 Ni- beads 純化啊？答案很簡單，那個時候根本沒有molecular cloning 這些技術，也沒Ni-beads 這些東西，Nieads 也是親合層析的一種，是好多年以後才發明的。這個學生有一天突發奇想，既然inhibitor 可以與enzyme 結合，為什麼不能把inhibitor 固定在beads上面，然後用來純化蛋白呢？後來他試了一把，結果非常成功。搞笑的是，anfinsen 自己很懷疑這個技術是否能work, 勉強答應把自己名字署在在那個學生的文章，還強調如果沒有別人能重複，自己心就是懸著的。呵呵。從此以後，各種各樣的親合層析層出不窮，成為生物實驗室蛋白質純化的最主要工具。
八卦完歷史，現在介紹一下親合層析的種類。通用的親合層析包括IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)和IAC(Immunological Affinity Chromatography)。這些東東大家應該都熟，類似於Ni beads, protein A beads 之類的東西， 幾乎所有人都會用到。需要動點腦筋的是一些利用特定蛋白質特定性質的親合層析。比如我們實驗室研究的糖基轉移酶吧，有兩個反應底物，一個是nucleotide-sugar,另一個是一個小蛋白質 EGF repeats。 由於這個酶與兩個底物都有結合， 所以可以把這兩種底物分別結合在beads 上，然後跑兩次親合層析。AP-1 的純化呢，則是利用了轉錄因子與DNA 序列的特異結合。所以呢，在做親合層析之前，一定要根據蛋白質本身的特點來選擇相應的ligand。決定了ligand 之後呢，就得考慮怎麼把ligand 偶連在beads 上了。
CNBr 活化是最常用的一個方法。原理很簡單，CNBr 的碳對beads 上的羥基發起親電進攻，產生一種叫cyclic imido carbonate 的中間產物, 蛋白質或者核酸的伯胺基團(primary amine , -NH2) 與其發生反應， 形成共價鍵聯在beads 上。 蛋白質的primary amine 主要來自於 lysine, 如果要偶連的蛋白沒有lysine 用這種偶連方法就不好。DNA 的primary amine來自於AGC 三種鹼基。DNA 是雙鏈互補的結構，鹼基上的primary amine 都要形成氫鍵。所以呢，要想把DNA oligo 固定好，必須得有不配對的overhang 才行。這是一個小竅門，但是給我們的一個啟示是，要做好affinity resin, 了解一些基本的偶連方法的化學原理是很有用的。
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