作者已不可考，如有人知道請告知
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（五）"萬金油"buffer
Dr. Burgess 這人特有意思，喜歡吹噓他發現的小trick。比如，他得意說他是全美國最早用coomassie blue 染蛋白膠的人。據他說，六幾年的時候他看到一個澳洲的老兄的一片文章,講述一種新奇的染料叫考馬市亮藍, 比當時流行的染料amido black 靈敏十倍以上。所以他就寫了一封信要了一些，結果效果奇好。我們聽得都目瞪口呆。
不過Burgess 最自豪的，還是他的“萬金油”buffer。他告訴我們說，他幾十年了，總喜歡用這個buffer 的配方，什麼蛋白都喜歡這種buffer, 可以說到了包治百病的神奇地步。儘管他吹得神乎其神，配方卻十分簡單。這個buffer 叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是這樣的:
50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol
Tris EDTA NaCl 這三樣都沒什麼，真正關鍵的是5%glycerol。有了這個glycerol，很多蛋白，尤其是酶會十分穩定。這個穩定的效果是十分驚人的。Dr.Burgess 就此跟我們講了他的經歷。六十年代的時候，他還是個小博士後，在watson 實驗室裡幹，主要是純化細菌RNA polymerase 的各個亞基。那時候一個大問題是RNA polymerase 純化出來後十分不穩定, 放冰上, 過30分鐘，活性還會損失一半。Burgess 有一次不小心出了錯誤，把純化出來的RNA polymerase 和glycerol 混合了。結果意外發現，RNA polymerase 變得十分十分的穩定。
穩定到什麼程度呢,就是你把這個酶加上50%glycerol，用平信從美國寄十幾天到澳洲，活性還有7~80%！另外Burgess 也提到，如果要保存的蛋白有二硫鍵，加一點DTT，防止蛋白形成非天然的二硫鍵, 也會對蛋白質的穩定有好處。
為了讓我們對這個 "萬金油"buffer 的好處有感性認識，Burgess 設計了一個實驗讓我們做。
他之前已經準備好了在大腸桿菌中表達的GFP 包涵體(inclusion body)。我們把包涵體分成兩部分，一部分用guanidinium hydrochloride（鹽酸胍）溶解變性，另一部分用sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸鈉）溶解變性。然後把這些溶解的GFP 溶液分到一個96 孔板上,每個孔10微升，然後加入２０倍的refolding buffer 來稀釋，稀釋了之後，變性的GFP 就開始重折疊。我們有一個hampton 賣的refolding 試劑盒，內有十幾種不同配方的refolding solution。我們試了所有這些buffer 同時還試了TGE, TGE+15% glycerol, TGE+35% glycerol, TGE+45%glycerol,這四種buffer。由於GFP 折疊好了才能發螢光，用一個fluorescence plater reader，我們可以實時監控折疊的效果。結果讓人很吃驚，Hamton 賣的這個試劑盒，雖然配方都很fancy,但是一塌糊塗，沒有一種溶液能讓GFP 重折疊的很好。相比之下，TGE 的四種溶液都很好，GFP 重折疊的效率是hampton kit 的幾十倍。最強的是TGE+35% glycerol。另外，不論是用Gudn HC 變性還是用sarkosyl 來變性，TGE+glycerol 的重折疊的效果都很好。
實驗結果出來後，看著我們驚訝的表情，Burgess 臉上都笑開花了，呵呵。這個實驗我還學到的一個教訓是,不能迷信商業化的kit, 很多kit 吹得很牛，但並不一定真的好用。
（六）興風作浪的乳糖(lactose)
晚上每天都有人做報告，我覺得讓我收獲最大的是Bill Studier 的報告。本來這個報告是後來才聽到的， 但是由於Burgess 的模塊是惟一的涉及大腸杆菌鐘表達蛋白的，我把這一段提前來說說。Studier 這老哥是Brookhaven National Laboratory 的，一生研究T7 噬菌體，也是T7 RNA polymerase induction system(pET 系列質粒)的發明者。T7 系統在大腸杆菌表達蛋白的應用實在太廣泛了，但凡表達蛋白的兄弟姐妹們的不可能不知道這個系統。長話短說，pET 系列的質粒都用T7 promoter 來控制基因的表達。T7 promoter 只能被T7 RNA polymerase 識別，而這個咚咚大腸杆菌是沒有的。但是有一些溶原菌株,染色體裡面已經整合入了由LacUV promoter 和lac operon 控制的T7 RNA polymerase 基因片斷。如果在細菌培養基裡面加入IPTG, 來誘導T7 RNA polymerase 的表達，就可以啟動目的蛋白的表達。
這個系統非常強大，原因在於T7 RNA polymerase 工作起來非常有效率，效率高到什麼地步呢？就是表達一個蛋白，表達量可以占到大腸杆菌總蛋白量的50%! 大家可以想像，這種系統雖然很強大，但是表達量太大，對大腸桿菌有毒性，造成的結果就是大腸桿菌十分排斥表達蛋白的質粒。
這一點我深有體會。我曾經想用細菌表達一個蛋白,而且估計這個蛋白會形成包涵體。奇怪的是，用質粒轉化蛋白表達菌株BL21(DE3)怎麼也不能轉化，鋪的板一個菌落也沒有。
我當時就懷疑是因為表達的蛋白對大腸桿菌有毒性，僅僅是本底的一點表達就足以殺死細菌。我來來回回一共轉化了五六次，最後 終於找到了唯一的一個菌落。雖然當時我懷疑過本底表達是罪魁禍首，但是我沒有仔細想過本底是怎麼來的。
這個問題到了bill studier 做報告之後，才真相大白。原來我們一般用的LB broth 有三種成分，其中一種是tryptone。Tryptone 是caseine 的酶解產物，而casein 又是milk 裡提取而來。
由於milk 有乳糖(lactose)，tryptone 裡面也有乳糖的污染。Bill studier 研究發現即使很微量的lactose 也能有效的誘導蛋白表達。原來如此！！！
所以要解決我原來的那個問題，用一種不含有乳糖的media 做培養板就完事了。有意思的是，細菌有一種很有意思的特點，如果培養基裡有足量的glucose，細菌會優先攝取glucose，而不能攝取lactose。Bill studier 根據這個特點研究出一種可以自動誘導的培養基。這種培養基含有成比例的glucose 和lactose。細菌首先攝取glucose，不攝取lactose，當細菌長到一定密度，耗完glucose 之後，就開始攝取lactose，從而開始誘導表達。所以用這種培養基養菌，很省事，接種了第二天收細菌，提蛋白就行了。
最後Bill studier 老爺子特別強調的是細菌的供氧。氧氣是限制細菌生長最重要的瓶頸，如果有足夠氧氣在培養基裡面，大腸杆菌的密度可以從一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30！要提高培養瓶的供氧，可以用baffled flask。這種flask 的瓶底邊緣有幾處凹陷(類似於可樂塑料瓶底那樣的形狀)，能有效增加空氣的培養基的混合。
最後，詳細內容可以見下列文獻:
Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005)
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