作者已不可考，如有人知道請告知
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（十七）何去何從
上一章提到從大鼠肝臟提取質膜的方法。質膜準備好了，下一步就得考慮怎麼溶解質膜。
最主要的問題是：用什麼去垢劑呢？Dr.Lin 在這一步試驗裡面要求每一組中的四個人各選一種去垢劑來溶解質膜，純化完之後再比較不同去垢劑的蛋白質純化效率，看看哪一種去垢劑最有效。選擇去垢劑很簡單，無非是想讓膜蛋白能被充分的溶解解離下來，同時又不使蛋白變性。事實上，純化膜蛋白時去垢劑的選擇是沒有規律可循，除了一些顯而易見的不適合做純化的去垢劑(比如SDS)外，很難講什麼去垢劑好什麼去垢劑不好。所以，只能具體問題具體分析，一個一個去嘗試。我們這一組人選的四種去垢劑分別是: Triton X100, Sodium Cholate,Chaps, 和Octyl glucoside。我選的是Octyl Glucoside。
好了，我先來講講去垢劑的小常識。去垢劑其實是很大一門學問，我幾年前就花過好多力氣來學習其中的一些知識，但到現在為止還是只懂了一些皮毛。這裡就權當拋磚引玉了。
首先，什麼是去垢劑(detergent)呢？就是同時具有疏水和親水兩種基團的化合物。雖然脂類化合物也有類似性質，但是去垢劑能夠形成膠束(micelle)，所以相比之下非常易於在水中溶解。去垢劑的疏水基團一般是下面三種(1)直鏈或者支鏈烷基結構(2)類固醇之類的多元環結構(3)取代苯基結構(比如大家常用的Triton X100 或者NP40)。去垢劑的親水基團一般有(1)羧酸基團，比如膽酸鈉(sodium cholate) (2)兩性離子基團, 比如CHAPS (3)糖類衍生物,比如Octyl glucoside, (4)聚乙氧乙醇基團, 比如Triton X-100 和NP-40。 Triton X100 和NP40 大家都用得比較多。它們實際上是同一種去垢劑，疏水基團是取代苯基，而親水基團是聚乙氧乙醇基團。我想強調的一點是，聚乙氧乙醇基團與氧氣很容易發生反應形成過氧化物, 如果用在蛋白質純化裡面，很有可能會破壞蛋白質的活性。所以一般商業化的,比較純的NP-40和Triton X-100 都是小包裝，而且在包裝瓶子裡面充有惰性氣體。
選擇適當去垢劑來純化膜蛋白，有一些實際問題必須先想好。我強烈建議大家以後選擇
和使用去垢劑的時候先考慮以下幾個問題：
(1)選擇的去垢劑是否干擾蛋白質濃度的測定？
類似於Triton X100 之類的去垢劑有苯環結構，所以在280nm 有很強的吸收。而相比之下CHAPS 和膽酸鈉之類的去垢劑就沒有這個問題。另外，有些去垢劑會嚴重的干擾一些protein assay。比如常用的Bradford assay，用的是commassie blue G-250 染料。這種染料在酸性條件下呈現為褐色膠體物質，但在與疏水物質結合之後會變得穩定而呈現藍色。所以可以想見，這種染料不單能染蛋白質，也能染一些去垢劑。我們在實驗一開始專門做了測試，發現Triton X100 和sodium cholate 對Bradford assay 干擾比較嚴重，chaps, 尤其是Octyl glucoside 基本上沒有什麼干擾。遇到這種干擾問題，要麼換去垢劑，要麼換protein assay 方法。
(2)是否需要在以後的步驟裡面去掉或者置換掉去垢劑？
去掉或者置換掉去垢劑是一件很麻煩的事情。因為很多去垢劑會形成膠束結構，分子量非常大，所以沒法用簡單的透析或者超濾來去掉。比如大家常用的Triton X100 和NP40, 單體分子量是628,膠束的單體聚集數是140, 所以膠束的分子量有87KD 了,這顯然是沒有辦法用透析來去掉的。相比之下CHAPS 單體分子量615,聚集數是10, 膠束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。
(3)是否需要在以後的步驟裡面用到離子交換層析或者疏水作用層析？
離子型去垢劑會與相應離子交換柱結合得很好，干擾蛋白質的純化。所以如果要用到離子交換柱，要用非離子型或者兩性離子型的去垢劑。另外，由於去垢劑有疏水基團，一般用了去垢劑之後，就不應該在後續步驟裡采用疏水作用層析的方法了。
(4)如果在後續步驟中選用凝集素層析, 選用的去垢劑是否構成干擾？
凝集素是一種植物中提取的一系列可以與糖基結合的蛋白。因為很多膜蛋白都有糖基修飾，凝集素層析可以利用這種性質來純化一些膜蛋白。類似與Octyl Glucoside 的去垢劑，親水基團是糖或者糖的衍生物，有可能與凝集素結合，降低凝集素的純化效果。比如ConA agarose 常常被用來純化具有High-mannose type N-glycan 的蛋白質，與mannose 和glucose都能結合。如果此時用Octyl glucoside，就無法純化蛋白了，因為Octyl glucoside 的親水基團是一個glucose。
(5)是否需要用弱的去垢劑來去掉soluble protein?
有時候用去垢劑並非完全是用來溶解膜蛋百，其實也可以用來去掉一些可溶蛋白雜質。比如Sodium cholate 是一種很弱的去垢劑，雖然不能用來很有效的溶解insulin receptor 之類的膜蛋白, 但是可是用來處理plasma membrane prep, 去掉大量的可溶蛋白雜質。
(6)是否需要用去垢劑來做Two phase partitioning？
Triton X114 是一種很特別的去垢劑，在室溫下很容易溶解在水中，但是在３０攝氏度以上會從水相中脫離出來，並且連帶的把膜蛋白也一起拽出來。這樣呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分開。這種方法叫做，two phase partitioning。我並不太喜歡這種方法，因為有一組人做了這個實驗，感覺分得並不是那麼乾淨，在可溶相還是有不少insulin receptor。
(7)去垢劑的用量是否足夠?
要充分的溶解膜蛋白，去垢劑的用量必須足夠才行。我們在試驗中，先測了一下起始樣品的蛋白總濃度，然後以detergent : protein 5:1 的比例加去垢劑。
(8)選用的去垢劑是否影響所純化蛋白的活性？
有些情況下，某些十分嬌貴的蛋白質對一些去垢劑很敏感。問題是，很難預先就知道那種去垢劑會降低蛋白活性。但是，我覺得大家至少得意識到，去垢劑很有可能干擾蛋白活性的。我舉一個例子。我是做糖基轉移酶的。有一種酶叫Protein O-mannosyltransferase 1 是一種膜蛋白，跟muscular dystrophy 有關系，是一個研究熱點。很多實驗室都懷疑這種蛋白是糖基轉移酶，但是很長一段時間裡面，很多實驗室發現表達的重組蛋白都沒有活性。一直到前兩年，終於有一個實驗室證明了這個蛋白是有活性的。之所以很多實驗室之前都不成功，其中一個重要因素就是去垢劑。Triton X100 和NP40 是很常用的去垢劑。這個成功的實驗室發現，如果用常規濃度下的Triton X-100，表達的Protein O-mannosyltransferase 完全沒有活性，相比之下用了Octyl thio-glucoside 就有活性了！所以呢，如果大家試圖表達一個膜蛋白，卻沒有活性，不妨換一下去垢劑，說不定會有意外的驚喜。
（十八）凝集素層析
我們用去垢劑溶解了膜蛋白之後，緊跟著的一步就是用Wheat Germ Aglutinin(WGA) agarose 來部分純化insulin receptor。WGA 是凝集素(Lectin）中的一種，而Lectin 指的是可以與糖基結合的蛋白質。現在常用來做蛋白質純化的凝集素絕大部分是從植物中提取出來的。絕大部分膜蛋白的extracellular domain 和分泌蛋白都有N-linked glycan 的糖基修飾。根據這個性質，用固定有適當的凝集素的beads，比如WGA agarose 或者ConA agarose 可以部分提純膜蛋白。注意，只能是部分提純，凝集素層析並不能一步登天，讓蛋白質比活力一下子提高上千倍，至多幾十倍就已經很不錯了。但儘管如此，凝集素層析是一種很好的辦法，因為buffer 條件非常溫和，洗脫液是加了糖的buffer，透析什麼的也方便，非常非常適合於和其他層析方法偶連起來用。
純化膜蛋白用的最主要的兩種凝集素是WGA 和ConA。談到這裡，我先向大家介紹一下N-linked glycans。N-linked glycans 是哺乳動物細胞中最常見的一種糖基修飾。這種糖基是加在膜蛋白的extracellular domain 上面。如果膜蛋白有這個sequence, N-X-S/T，最前面的Asparagine 多半被N-glycan 修飾。N-glycan 是一個Oligosaccharide 結構，好像一個分叉的樹枝一樣。膜蛋白的新生肽鏈在被翻譯合成的同時會被直接塞入ER lumen，同時就會被加上一整個樹枝狀的N-glycan core。這個N-glycan 加上去之後，並不是就大功告成了，而是要經歷一系列“裁減”，有的糖基會被去掉，新的糖基又會被加上，這樣最後的N-glycan structure 往往是千奇百怪。 但是N-glycan 的“主幹”都是相似的。
Man Man
\\ /
\\Man/
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GlcNAc
|
GlcNAc
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N-X-S/T
Man 代表Mannose 甘露糖，而GlcNAc 代表N-乙酰葡萄糖胺。
保留在ER 或者Cis-Golgi 的膜蛋白,N-glycan 往往是High-mannose type。在這種N-glycan的末端有很多甘露糖(mannose)修飾。最適合於純化這種蛋白的凝集素是ConA。ConA 主要識別alpha-mannose, alpha-glucose 和alpha-GlcNAc,所以可以這三種糖溶液來做洗脫液。分泌出去的蛋白，或者已經到細胞表面的膜蛋白的N-glycan 往往是complex type。這種complextype N-glycan 的末端往往修飾有Sialic acid（唾液酸，一種帶負電的糖）和GlcNAc。而WGA主要識別GlcNAc 和Sialic acids，所以特別適合於純化這種類型的蛋白，洗脫液可以用GlcNAc 和Sialic acid 溶液。
最後需要指出來是，純化一種特定蛋白，選擇用什麼凝集素是完全經驗性的，需要提前測試才知道的。
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