2009年5月14日 星期四

RT-PCR、PCR、Real time-PCR

先簡單介紹聚合鏈反應(PCR, polymerase chain reaction)吧!聚合酵素(polymerase)是負責DNA合成的酵素,在1955年發現,一開始生物學家的想法很簡單,就是模仿生物體內的反應,把模板
DNA(template)和引信(primer)加上合成DNA的原料(dNTP,核甘三磷酸)以及聚合酵素放在一起,應該就可以在一個試管內產生DNA合成的反應,這樣的方式比藉由細菌增殖質體(plasmid)內所夾帶的特定基因還要快速簡單得多,隨後1977年在溫泉中發現的ThermusAquaticus細菌中所含有的聚合酵素(俗稱Taq polymerase),因為具有耐高溫的特性,所以能夠勝任PCR的循環(cycle)主要三步驟:變性(denaturation)、引信附著(annealing)、聚合化(polymeration),要以少數的模板合成大量的DNA需要20至30個循環,一開始的酵素是由大腸桿菌分離的Klenow片段(fragment of Klenow),並不耐高溫,直至Taq聚合酵素被發現後才真正造成PCR實驗的重大突破。

那麼RT-PCR又是什麼東東呢?RT指的是逆轉錄?(reverse transcriptase),也就是把RNA
轉錄成DNA的酵素,因為一般生物原則(dogma)是DNA轉錄成RNA,再由RNA轉譯成蛋白質,
所以由RNA變成DNA便被視為一種逆向轉換,才加上reverse,RNA病毒(例如愛滋病)就是靠
著合成這樣的酵素才得以將RNA轉變成DNA。RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄
為DNA,再進行聚合?反應,這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一,因為分解RNA的酵素
(RNase)無處不在,只要溫度一升高,RNA就非常容易被分解,科學家們只好先將它轉變為
互補DNA(cDNA),再進行聚合脢反應。

至於即時RT-PCR(real time RT-PCR)則是利用非常敏感的螢光染劑(例如Sybr Green),當
試管內形成雙股DNA時,這個螢光染劑就會與之結合並且大放光芒,機器在每一個循環都
紀錄釋出的螢光指數,由於聚合連鎖反應會造成DNA成對數性的增加(每個循環就增加2倍
,那30個循環就會增加2的30次方倍),螢光指數也會隨著DNA的複製(形成雙股)而增加,
科學家發現一件很有趣的事,螢光指數突然開始快速增長的某個循環(這個加速的起點是
由一個叫做threshold的值來定義),這個循環則稱為Ct(cycle of threshold)的值與起初
cDNA的含量成反比(當然,只限於同一次PCR反應中的比較性定量),也因為這個發現,所
以我們能夠用推測當初的RNA含量,進而研究細胞內基因表現的變化。這又要說到PCR是非
常不精確的一種反應,我們拿等量的DNA來進行同一個PCR,30個循環之後,所得到的
band(我們把反應後的產物拿去跑電泳,溴乙烷ethyl bromide染色後用放射顯影
autoradiography後呈現的條狀影像)很有可能會有不一樣的粗細程度,所以嚴格來說PCR
是不能用來定量的,然而即時聚合鏈反應則由於使用了敏感的螢光劑,所以突破了這個限
制,在嚴格的控管情形下,是可以定量細胞內基因的表現程度的。

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