RT-PCR、PCR、Real time-PCR

先簡單介紹聚合鏈反應(PCR, polymerase chain reaction)吧！聚合酵素(polymerase)是負責DNA合成的酵素，在1955年發現，一開始生物學家的想法很簡單，就是模仿生物體內的反應，把模板
DNA(template)和引信(primer)加上合成DNA的原料(dNTP,核甘三磷酸)以及聚合酵素放在一起，應該就可以在一個試管內產生DNA合成的反應，這樣的方式比藉由細菌增殖質體(plasmid)內所夾帶的特定基因還要快速簡單得多，隨後1977年在溫泉中發現的ThermusAquaticus細菌中所含有的聚合酵素(俗稱Taq polymerase)，因為具有耐高溫的特性，所以能夠勝任PCR的循環(cycle)主要三步驟:變性(denaturation)、引信附著(annealing)、聚合化(polymeration)，要以少數的模板合成大量的DNA需要20至30個循環，一開始的酵素是由大腸桿菌分離的Klenow片段(fragment of Klenow)，並不耐高溫，直至Taq聚合酵素被發現後才真正造成PCR實驗的重大突破。

那麼RT-PCR又是什麼東東呢？RT指的是逆轉錄?(reverse transcriptase)，也就是把RNA
轉錄成DNA的酵素，因為一般生物原則(dogma)是DNA轉錄成RNA，再由RNA轉譯成蛋白質，
所以由RNA變成DNA便被視為一種逆向轉換，才加上reverse，RNA病毒(例如愛滋病)就是靠
著合成這樣的酵素才得以將RNA轉變成DNA。RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄
為DNA，再進行聚合?反應，這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一，因為分解RNA的酵素
(RNase)無處不在，只要溫度一升高，RNA就非常容易被分解，科學家們只好先將它轉變為
互補DNA(cDNA)，再進行聚合脢反應。

至於即時RT-PCR(real time RT-PCR)則是利用非常敏感的螢光染劑(例如Sybr Green)，當
試管內形成雙股DNA時，這個螢光染劑就會與之結合並且大放光芒，機器在每一個循環都
紀錄釋出的螢光指數，由於聚合連鎖反應會造成DNA成對數性的增加(每個循環就增加2倍
，那30個循環就會增加2的30次方倍)，螢光指數也會隨著DNA的複製(形成雙股)而增加，
科學家發現一件很有趣的事，螢光指數突然開始快速增長的某個循環(這個加速的起點是
由一個叫做threshold的值來定義)，這個循環則稱為Ct(cycle of threshold)的值與起初
cDNA的含量成反比(當然，只限於同一次PCR反應中的比較性定量)，也因為這個發現，所
以我們能夠用推測當初的RNA含量，進而研究細胞內基因表現的變化。這又要說到PCR是非
常不精確的一種反應，我們拿等量的DNA來進行同一個PCR，30個循環之後，所得到的
band(我們把反應後的產物拿去跑電泳，溴乙烷ethyl bromide染色後用放射顯影
autoradiography後呈現的條狀影像)很有可能會有不一樣的粗細程度，所以嚴格來說PCR
是不能用來定量的，然而即時聚合鏈反應則由於使用了敏感的螢光劑，所以突破了這個限
制，在嚴格的控管情形下，是可以定量細胞內基因的表現程度的。