作者已不可考，如有人知道請告知
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（三）不溶的sigma32
四月六號早上，我們開始了第一模塊的實驗，Burgess 教授負責。這老兄研究了一輩子E.Coli 的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一個蛋白質復合體，只有合成RNA 的活性，卻沒有識別DNA 的能力。Sigma 系列因子能夠識別啟動子, 並且與核心酶結合，從而實現轉錄。我們這個實驗的核心主角就是其中一個因子，叫sigma32。
Sigma32可以識別heat shock genes 的啟動子。Sigma 32 在大腸桿菌裡大量表達的時候，絕大部分形成了不溶的包涵體(inclusion body)，我們的任務就是要用變性劑溶解變性不溶的蛋白，然後做重折疊。所有的buffer 幾乎都已經配好了，所以直接做就行了。我們先用1% Triton 來溶解
細菌本身的一些蛋白，inclusion body 相當穩定，不溶於triton，所以這一步，絕大部分垃圾
就被去掉了。
下一步就是用變性劑來溶解inclusion body。用什麼好呢？Burgess 教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N-十二烷基肌氨酸鈉）是一種比較強的陰離子去垢劑，0.3%的濃度就可以讓包涵體
溶解。sarkosyl 的優點是，雖然在高濃度下有變性作用，低濃度下卻對蛋白質有穩定的作用。所以用sarkosyl 做重折疊之前的變性劑是再好也不過的了。Burgess 還要我們試了經典的 Gudn HCl（鹽酸胍)來變性，作為對比。inclusionbody 在這兩種變性劑下很容易就溶解了。然後我們得去掉變性劑，做重折疊。怎麼做呢？方法有很多種，最簡單的是透析，把變性劑全部換掉。這個方法Burgess 並不喜歡，因為，透析是個緩慢的過程。在透析袋裡面，蛋白的濃度還是很高。折疊中間產物容易相互接觸形成不溶的聚合物。另一種方法是突然稀釋變性的蛋白，由於蛋白濃度相對與透析低了很多，好一點。但是問題也是類似的。Burgess 提議用逐步滴加稀釋的辦法。就是放一大燒杯的緩衝液，裡面有一個磁石可以不斷混合液體，然後一滴一滴加入變性的蛋白溶液。由於燒杯裡的溶液蛋白量是逐漸增加的，所以一開始蛋白折疊中間產物能夠相互作用的幾率大大降低了。Burgess說的還真像那麼回事，可事實上，嘿嘿。我們先用試著重折疊Gudn HCl 溶解的Sigma32。一開始還好，滴到後來，溶液就變渾濁了，最後幾乎成了衝淡了的牛奶那樣的東東。Burgess臉色不好看，說不應該這樣的。我們一離心，沉澱出來一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清液跑了一個Poros HQ 50 陰離子交換柱，拿到的蛋白很少，回收率小於5%。失敗啊。從這裡開始，我要岔開一下，講一些跟這個模塊實驗沒太大關係，但是很有意思的東西。
（四）Hydrostatic pressure和跑小柱子的trick
Dr. Burgess 假定我們對蛋白質純化一無所知，所以講得很細緻。比如他特別提到了disposable column 的用法。這種小柱子很簡單，把beads 倒進去，沖洗一下就可以用來純化蛋白了，很方便。惟一的問題是，由於是依靠重力跑，速度有時候會十分慢。液體流經柱子速度由ydrostatic pressure (靜流體壓力）來決定。而hydrostatic pressure 又是由實際柱高(即液體經過的長度)來決定。如果你嫌液體流得太慢（尤其是洗柱子的時候），可以在柱子下端出口連一個長的塑膠管子或者針管，這樣速度會快很多。這是很簡單的小trick, 但我覺得對初做蛋白質純化的人還是很有幫助的。
我知道一個例子。我原來很喜歡女生A, 有一天晚上主動在她實驗室等她做完實驗，就開車送她回家。這一等不得了，從晚上七點等到了凌晨一點。這個過程中，她好像沒什麼事情，但是每隔20 分鐘，她就會去一次cold room。作完實驗了之後，我好奇的問她，到底是什麼試驗花了這麼長時間，結果她說她在用一個disposable column 純化蛋白，由於beads稍微多了一點，速度很慢，而protocol 有一步要求用數百毫升的洗液來衝洗柱子。所以她每隔二十分鐘就去加洗液，所以白白花了好幾個小時。我聽了之後都要ft 了,沒想到她們實驗室竟然沒有人告訴她, 有簡單的辦法可以讓柱子跑得快一點的。只要在下端出口加一個長管子，她至少可以少等兩個小時。
當然最簡單的辦法還不是這個，最簡單的辦法的是把盛有洗液的容器放高，然後利用虹吸的原理讓液體 源源不斷的流經柱子。同時，柱子的下端連上塑膠管，彎成一個連通器，這個連通器的高度應該略高於柱面，這樣衝洗結束後，柱子就不會干。如果用這種方法，A就不用在實驗室待一晚上了，因為一切都是自動完成的。
我現在跟A已經完全沒有來往了, 但我對她映像還是十分深刻，主要就是因為她那晚跑柱子的經歷。話扯遠了，現在再回到蛋百質純化課。
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