作者已不可考，如有人知道請告知
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（十一）核抽提物
上回談到純化AP-1 轉錄因子的大致流程。其實在過柱子之前的核抽提物的準備也是十分關鍵的。從天然產物中純化蛋白，如果大概知道蛋白在什麼細胞器官，把細胞器先分離出來作為純化的起始原料，可以省好多事情。因為細胞器官的分離的方法已經很成熟了。核抽提物是怎麼準備的呢？首先，融解Hela 細胞。我們在這個模塊用的細胞都不是自己長的，而是直接從一個公司Biovest 買來的。據說這個公司有NIH 的補貼，所以價錢不貴。一升media 的Hela 細胞才要１７刀。凍存在-80 度的hela 泡在有glycerol 的buffer 裡面，第一件事情就是要用有鎂離子的PBS 來沖洗幾遍。然後用一種低滲buffer 來重懸細胞。這種低滲buffer 鹽濃度很低，所以由於滲透壓的影響，hela 細胞膜會變得比較脆弱。這個時候呢，把重懸的細胞用Dounce 勻漿器處理一下,把細胞膜弄破。低滲buffer 裡頭雖然鹽濃度很低，但也不是沒有鹽在裡面。主要有兩種成分，一個是10mM KCl ,另一個是 1.5mM MgCl2。KCl 沒有什麼好說的，可以換成NaCl。MgCl2 就關鍵多了。鎂離子可以穩定細胞核, 讓細胞核不至於在破碎細胞的時候就破裂。當然說是這麼說，一些轉錄因子還是可能在勻漿的過程就漏出來。細胞膜破碎之後，細胞核還是基本完整的，細胞質裡面ER, Golgi 之類的東東都漏出來了。然後再來一個低速離心。細胞核是比較重的，所以一離心，馬上就沉澱下來了。而其他細胞質或者細胞膜的成分比較輕一些，還留在上清裡面。現在想起來，細胞器官的分離，幾乎無一例外都是利用細胞器比重不一樣來分離的。細胞核是最好分離的了，因為比其他的膜結構重得多。有些細胞器，比如要把Golgi 和ER 分開，是個十分麻煩的事情，因為比重相差太小了。有些時候，可以用一些古怪的辦法來分離。比如lysosome 吧，比重和粒線體及過氧化酶體很相近。一種辦法就是往一堆無辜的老鼠注射一種特殊的去垢劑叫Triton WR1339。耗子根本不能分解吸收這種化合物，就積累在肝臟細胞的lysosome 裡面，使lysosome 比重變輕了一些，這樣就可以把lysosome 從mitonchondria 和peroxysome 分出來了。話扯遠了，現在再回到AP-1purification。
細胞核雖然被沉澱下來了，但裡面還有很多染色質,如果DNA 都降解漏出來，麻煩就大了。所以下一步就是用高鹽buffer(0.42M KCl)來破碎細胞核。核膜，染色質之類的垃圾不能溶解，轉錄因子之類的蛋白卻能溶解。再一離心，取上清就行了。我們要的轉錄因子就在這裡面。按理說，到這一步就可以上柱子了，但是這種上清溶液裡面還有不少histone H1，可以抑制體外轉錄反應。為了去除Hisone, 我們又做了一步硫酸氨沉澱，histone 由於太小，沉澱不下來，而轉錄因子什麼的都可以被沉澱下來。沉澱重懸一下就可以跑Sephacryl S-300 的柱子了。
（十二）Gel filtration的先天缺陷
上一篇講到核提取物。實驗的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。
這一步實驗是整個課程中第一次跑凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography)，我感覺還是
很激動的。Gel filtration 是色譜中極其重要的一個種類。我先來談談原理吧。Gel filtration
柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。這些微珠呢，並不是實心的，而是有很多孔狀結構。
當蛋白質樣品經過這些微珠的時候，如果蛋白質分子體積太大，不能通過微珠的孔狀結構，就會繞過微珠，很快的被洗脫下來。如果蛋白質分子體積不是那麼大，可以通過微珠的孔狀結構，就會遲一些被洗脫下來。這樣，蛋白質分子可以根據大小而被gel filtration column 分開。
Gel filtration 和其他色譜方法一個顯著的不同是：Gel filtration 並不依賴蛋白質分子與柱材料的結合來分離蛋白。這個特點的一個好處是，所有的蛋白樣品最後都能被洗脫下來，柱子重複用也不會有什麼問題。但是這個特點也給Gel filtration 帶來了一個嚴重的缺陷：低分辨率。分辨率包括兩個因素，一個是兩個蛋白峰的距離，另一個是，蛋白峰的寬度。由於蛋白在gel filtration column 裡面並不與柱材料相互結合，所以很容易擴散(diffusion)，擴散的結果就是蛋白峰非常寬。這個寬度非常要命，很多時候即使用了很好的柱子，蛋白頂峰也大致能分開, 但是由於蛋白峰太寬，重疊在一起，這樣就很難分乾淨。另外，兩個不同大小蛋白的洗脫體積的差別與分子量差別的對數呈線性關系，所以可以想見，如果分子量相近（比如只差兩三倍）的話，洗脫位置也會相近，Gel filtration 是很難把兩個蛋白完全分開的。
說一件我的糗事。有一次一個師妹遇到了一個難題，表達一個GST-tagged 的蛋白有一個降解產物。她想要的蛋白50kD,而那個降解的產物有30KD。她問我該怎麼分開。我沒仔細想，就告訴她用Gel filtration。現在想起來，這實在是個昏招。當然，欣慰的是，該師妹最終沒有試gel filtration, 用別的方法解決了這個問題。:-)
如果要想蛋白峰寬度變窄一點，怎麼辦呢？就樣品而言，體積越小越好，理想狀況是小於柱體積的２％。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，這樣空體積就會小一些，擴散就不會那麼嚴重。另外柱子裡的微珠大小均勻一些也會有幫助。這種改進帶來的一個問題就是，需要用FPLC 之類的設備提供較高的壓力, 柱子才跑得動。另外分辨率好的柱子往往不能手工裝，得買預裝的柱子，這樣就很貴（很貴很貴！！！）。
嘮叨了一大堆，我想表達的一個中心意思就是：如果你想從一個蛋白質混合物很乾淨的把一個蛋白純化出來，Gel filtration 是肯定沒戲的。雖然gel filtration 不能很精細的純化蛋白，但是它還有另兩個非常重要的用途。一個是脫鹽，另一個是確定蛋白大小。這兩個用途
是其他種類的色譜沒法作到的。
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