2009年6月12日星期五

從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-5

作者已不可考,如有人知道請告知
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(九) 沉澱,沉澱,沉澱
上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉澱來去掉PEI (Polyethyleneimine)的步驟。不常做生化的同學可能對硫酸氨沉澱的方法不熟悉。但其實這種沉澱是蛋白質純化中及其重要的一種方法。說實話我過去也很少接觸,但是在這個課裡面,四組實驗中有三個都用到了這個方法,可見其重要性。硫酸氨沉澱是怎麼做的呢?其實很簡單,把磨細了的硫酸氨粉末往樣品溶液裡倒就行了,蛋白就會相繼沉澱下來。由於不同的蛋白,在不同的硫酸氨濃度下被分別沉澱下來,這種方法把蛋白質樣品粗粗的分離一下。這種方法對大量樣品尤其好用,因為比較方便快捷便宜。硫酸氨沉澱的優點是什麼呢?最大的優點是這東西雖然能讓蛋白質沉澱下來,但是不會讓蛋白質變性,所以沉澱下來的蛋白質一般可以重新溶解。其實沉澱蛋白質的方法有很多種,但是對於嬌貴的蛋白質來說,很多常用方法都太harsh 了。
我舉兩個例子把:TCA沉澱大家都熟悉的。TCA 是個強酸,施放出來的質子中和了蛋白質的負電荷,只留下正電荷與TCA 形成不溶物,從而變性。丙酮沉澱,通過改變介電常數來降低蛋白質的溶解度,從而沉澱,由於丙酮一類的有機溶劑可以與蛋白質的疏水表面相互作用,所以沉澱的同時,蛋白質也會變性。硫酸氨沉澱的機理是什麼呢?簡而言之就是鹽析(salt out)。蛋白質在溶液裡面溶解度和鹽濃度有關系。在低鹽濃度下,如果增加鹽濃度,會增強蛋白質的溶解,這是因為,鹽的離子與蛋白質表面的正負電荷配對,減少了蛋白質電荷表面相互作用的機會。
當鹽濃度高到一定程度的時候,過多的鹽會跟蛋白質疏水表面爭奪水分子, 以至於蛋白質疏水表面傾向於相互作用形成聚合物沉澱下來。
硫酸氨如果運用的好可以幫很大的忙。Dr. Burgess 講過一個例子。他有一年去一個公司做sabbatical。這個公司是做單抗的,有一個工序是要從ascites fluids 裡頭把抗體給純化出來。這個公司用硫酸氨沉澱的方法來粗分蛋白。Burgess 很驚訝的發現,這個公司竟然沒有做仔細的分析,就隨便用了一個很高的硫酸氨濃度,結果把抗體和serum albumin 一起沉澱了。但是其實可以用一個低一點的濃度,只把serum albumin 沉澱下來,從而把抗體和serum albumin 分開。Serum albumin 濃度是非常高的了,這樣一分,大大提高了後續純化步驟的效率。

Dr. Burgess 強調說,用什麼濃度把什麼蛋白沉澱下來,完全是經驗性的,而且每次都不一定能重複的。因為是否能沉澱下來跟蛋白質濃度有關係,而每次樣品內目標蛋白的濃度不一定一樣。有一個很簡單的方法可以用來估計蛋白質沉澱所需 酸氨的濃度。把樣品分成五份,每份分別加硫酸氨至20%, 30%, 40%, 50%, 60%,離心去掉沉澱,保留上清,再向上清裡面添加硫酸氨使濃度從20%到30%, 30%到40%, 40%到50%, 50%到60%, 60%到70%,離心保留沉澱,然後分析沉澱裡的蛋白,看看目標蛋白到底在哪裡,就完事了。

(十) 永遠的轉錄因子
第一個模塊的實驗結束以後,我們進入第二個模塊的實驗。這個實驗的指導教授叫AlCourey。這個模塊的實驗主要是要從Hela 細胞裡純化AP-1。AP1 是一種很重要的sequence specific 轉錄因子,在很多生理過程裡都有作用。AP-1 其實不是一種均一的蛋白質,實際上一種二聚體結構,要麼是Jun-Jun 或者是JunFos dimer。Jun 和Fos 都是alpha helix 的結構。Helix 的一邊有很多Leu,和另一個helix 形成Leucine Zipper 的結構,而helix 另一邊就是鹼性的氨基酸居多,所以可以和DNA 結合。這個轉錄因子看起來就像一雙筷子夾著DNA。sequence specific 轉錄因子是極其重要的一類蛋白質,真核生物的基因有5~10%是用來編碼這種蛋白的。這個模塊涉及的一些實驗是最經典的一些分離轉錄因子的方法,所以很有用。怎麼才能分離純化呢?首先要確定要純化什麼因子,換句話說就是要決定純化跟什麼特異DNA 序列相結合的轉錄因子。決定了這個,才能有一個活性檢測系統,才能真正開始純化。另外就是,可以把這種特異序列的DNA 固定在柱子上,然後做親合層析,純化效率會非常高。
整個純化過程是這樣的:首先製備Hela 細胞的核提取物,然後用硫酸氨沉澱的辦法粗分一下組分,小分子量蛋白(比如Histone H1) 因為無法沉澱而被去掉。到這裡比活力會增加到原來的2 倍。然後粗分的產物再跑一下凝膠過濾層析,比活力再提高到初始產物的5 到10 倍。凝膠過濾的產物再過DNA affinity column, 比活力從5-10 倍一下子提到了50~100 倍。到了這一步,AP-1 可以占到蛋白量的 10~50%。值得一提的是這個凝膠過濾層析。我們用的是Sephacryl S-300 HR 凝膠(一種聚丙烯酰胺凝膠),這種凝膠分辨範圍大概是10KDa 到幾千KDa,但是這種凝膠是比較粗的一種介質,分辨率不能跟superdex 之類的比。大概由於不是那麼精細,所以可以自己手工裝柱,我們用的柱子是Amersham 的XK26/40(直徑2.6cm, 高度40cm)。裝好的柱子分辨率真的是很
低,AP1 的洗脫體積跟空體積(void volume)相差挺小,而AP-1 只有40~50KD 已經很小了。這樣一來很多蛋白根本沒可能和AP-1 分開!這也就是為什麼這一步純化倍數很小的原因。這樣一來,為什麼要自找麻煩做這又貴又麻煩的一步呢?原因在於這一步可以去掉核提取物裡面的核酸酶,所以如果直接跑DNA affinity column, column 上的DNA Oligos 會被降解掉!另外一個原因是,核提取物有一些可以和DNA 非特異結合的蛋白,這些蛋白會飽和DNA affinity column,影響要轉錄因子的純化。
這個純化步驟說明,不同的純化手段必須加以精心組合才會有最好的效果。

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