從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-4

作者已不可考，如有人知道請告知
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（七）古怪的CDC6
這裡再給大家講一個在大腸桿菌中表達蛋白質的例子，一個很誇張的例子，但是很有啟發性。Bruce Stillman 是冷泉港的現任主管，是一個絕對的牛人。不但科學做得很好，而且還很愛國。他是澳洲人，在美國待了N 年，卻從沒有加入美國國籍，所以他只是外籍院士。
我們的晚間報告有一個是他作的。他主要研究真核生物的DNA 複製。這是一個到現在為止都沒有完全弄明白的領域。在報告裡面，他特別提到了表達純化CDC6 蛋白的經歷，我覺得十分有意思。這個蛋白, 用他的話說，是"a pain in the ass"。

CDC6 是幹什麼的呢？這要從ORC 說起。真核生物的DNA 有多個複製起始位點(replication origin)，ORC(Origin Replication Complex)是一個很大的蛋白複合體，可以識別這些複製起始位點。ORC 在整個細胞週期裡面都是與DNA 結合的。在G1 期裡面，CDC6 這個蛋白會與ORC 結合，同時讓MCM(DNA 解旋酶)也裝載到ORC 上，形成一個pre-replicationprotein complex。這個complex 一旦形成，DNA 複製的準備工作就完成，只等其他kinase的激活，細胞從G1 進入S 期，複製就開始。
Stillman 實驗室一直想表達酵母的CDC6 和ORC 的重組蛋白，然後做結構研究。但是到了CDC6，他們碰到了大麻煩。首先他們嘗試真核系統來表達，但是意外的是，他們發現表達出來的CDC6 完全沒有活性。然後他們嘗試用大腸桿菌來表達。首先發現37 度誘導表達出來的蛋白不溶，重折疊也沒有用。然後他們嘗試在室溫下誘導表達，發現蛋白雖然可溶了，但是都被降解了。然後呢，他們就想到了加一個GSTtag ,這下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是還是沒有活性。他們估計是因為GST 可以形成dimer，干擾CDC6 的正常功能。所以呢，他們重新做了一個Construct,在GST 和CDC6 序列中間加了一個蛋白酶切割位點。正當他們滿心歡喜的以為問題解決了的時候，意外又出現了。有GST 的CDC6 是可溶的，可是一旦把GST 切掉了，CDC 就沉澱出來了....#%#^&%$^#!!!
幾乎是山窮水盡了，但是做這個project 的博士後還是沒有放棄希望，他做了最後的孤注一擲。他猜到這個蛋白可能很不穩定，對緩衝液要求可能很高，所以他讓一個本科生連續試了十多種buffer，最後發現如果用磷酸鉀＋谷氨酸鉀緩衝液，切掉GST 之後CDC6 就不會沉澱了。Stillman 認為谷氨酸根和磷酸根跟氯離子相比更接近核酸，可能讓CDC6 更穩定。這個CDC6 一共花了他們18 個月時間, 卻就這一點小trick! 這以後，他們表達的CDC6 都有活性了，後來做了一系列的電鏡三維結構重構實驗，研究CDC6 和ORC 的復合體結構。Stillman 實驗室正在準備一篇文章要投到nature上去。大家等著看吧。

（八）“液體DEAE”
繞了這麼大一圈，現在再回到第一個模塊的實驗來。前面提到Dr.Burgess 要我們試Gudn HCl 溶解sigma32 之後的重折疊，結果很糟糕。我們接著試了用sarkosyl 做變性劑的蛋白重折疊。步驟和前一個類似，只是這一次是突然稀釋至25 倍體積。效果好了很多，至少沒有渾濁現像了。接著我們用Poros HS 50，一種陽離子交換柱，來把可溶的sigma32 分離了出來。為什麼這一次用Poros HS 50 而不是前面用的陰離子交換柱呢？因為sarkosyl 帶負電，會與陰離子交換柱結合得很好。再加上sigma32 很奇怪，既有負電的表面，又有帶正電的表面，所以可以用陽離子交換柱。值得一提的是絕大部分蛋白質都是偏酸性，所以陰離子交換柱用的比陽離子交換柱頻繁得多。
好了，聊完離子交換柱，現在回到Dr Burgess 要我們作的另一個很重要的實驗。Sigma32 在大腸杆菌過表達的時候，絕大部分都是inclusion body,但是也有一部分是可溶的。這些可溶的sigma 32 可以和細菌體內的Core RNA polymerase 結合形成複合體。我們這個實驗就是要把這個複合體純化出來。核心辦法是用免疫親合柱來純化。但是為了提高純化的效果，Burgess 要我們提前用PEI 沉澱的辦法來粗分一下。

PEI 是什麼呢？就是polyethyleneimine （聚乙烯亞胺）。這個東東我過去沒碰到，所以很感興趣。PEI 呢是一個帶正電的polymer，和酸性蛋白質和核酸結合以後聚合體沉澱出來。由於這種結合是受離子強度影響的，感覺上很像DEAE 那之類的性質，所以Burgess稱之為"液體DEAE"。RNA polymerase 和DNA 是結合的，所以PEI 沉澱DNA 的同時，把RNA polymerase+sigma32 都沉澱了下來。然後再用高鹽洗脫蛋白質，而DNA 和PEI 結合很緊密，所以還是在沉澱裡面。這樣一來，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。到了這一步，還有一個問題。就是洗脫下來的蛋白裡面還有PEI, 如果現在就用透析的辦法降低鹽濃度，PEI和蛋白會重新形成沉澱。所以下一步就是用硫酸胺沉澱的辦法把蛋白和PEI 分開。用低鹽buffer 重溶沉澱的蛋白,過免疫親合柱就行了。免疫親合柱就沒有什麼好說的了。最後結果很不錯，跑膠後用coomassie blue 就可以清楚的看到RNA polymerase 的各個亞基。