作者已不可考，如有人知道請告知
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（十五）AP1的活性測定
第二個模塊的實驗，DNA affinity chromatography 之後我們又跑了一個更精細的Gel filtration，用的是Amersham 賣的Superose 6 預裝柱子。純化步驟就只有這麼多了。剩下的就是一些活性測定。無論是sephacryl 分出來的組分還是DNA affinity column 分出來的組分，我們都測試了AP1 的活性。方法呢就只有兩種，一種是凝膠遷移率變動分析(EMSA)，另一種是DNA 水解酶I 足跡分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用來分析蛋白與特定DNA的結合能力。我過去沒做過這兩種實驗，所以感覺很新奇，做的也格外賣力，結果也還不錯。
Gel Mobility-shift assay 原理很簡單，把蛋白質樣品和P32 標記的寡聚核苷酸探針一起孵育十幾分鐘, 然後拿去跑一個低濃度acrylamide 膠。如果探針結合上蛋白了，速度會變慢很多，就會停滯在膠的上段；如果沒有結合上，探針就會自由的跑到膠的下段去。然後把膠拿去做放射自顯影就行了。跑膠的裝置塊頭挺大的，是用來跑DNA 測序膠的裝置。把兩大塊玻璃板和兩片spacer 夾起來之後，instructor 先做一個gel plug，就是配少量gel 溶液，然後加過量的TEMED，然後迅速加到玻璃板中間，這些膠還沒漏完就會凝固，所以會封住底端。
這是一個小竅門，據instructor 講，這個方法雖然很粗糙，但是比其他任何封底的辦法都管
用。還有一個小竅門。是這樣的，由於膠的濃度低，比較脆弱，另外尺寸比較大。跑完如果把一塊玻璃板從膠上拿開的話，膠的某些部分會分別粘在兩個玻璃板上，這樣取膠的時候就很容易把整個膠弄破。我們做膠的時候，指導老師要我們把一塊玻璃板的貼著膠的一面硅化（用sigmacote, 成分是氯化有機硅氧烷) 一下，使得這一面比較疏水，就不會與膠粘在一起了。這樣打開膠夾層的時候,膠只會緊緊貼在一面玻璃上面，把膠和這整塊玻璃拿去放射自顯影就行了。生物實驗要想令人心服口服，沒有對照是不行的。EMSA 也不例外。陽性對照很簡單，是看看系統能不能work。關鍵是陰性對照，來看蛋白質與探針的結合是否特異。
EMSA 的陰性對照有兩種，一種呢，是用來看和探針的結合的蛋白是不是特異的某一種蛋白。做法很簡單，就是蛋白質和探針孵育的同時加入抗那種蛋白的抗體，抗體識別蛋白質之後會形成更大的protein complex,在膠看起來就是探針的遷移率進一步降低了。這叫\"supershift\"。另一種對照呢，是看蛋白質與探針的結合是不是與探針序列有關，因為如果是非特異性的結合，純化就沒有意義了。這種對照也很簡單，在蛋白質與探針孵育的同時，加入沒有同位素標記的探針來競爭。如果加入完全同序列的競爭DNA 可以削弱protein-DNA interaction， 一兩個nucleotide 不一樣就無法削弱的話， 說明看到的探針與蛋白質的結合是跟探針序列緊密相關的。我們在實驗中用了第二種control, 效果挺驚人，僅僅是兩個nucleotide 和探針不一樣，競爭DNA 探針就沒法work 了。
Gel Mobility-shift assay 雖然能夠證明一段Oligos 是否能和蛋白質結合，卻還是不能告訴我們該蛋白質到底與哪一小段的序列直接接觸。DNAase I footprinting assay 正是用來解決這個問題的。DNase I 可以隨機的分解DNA，正常情況下，一段DNA 探針各處被酶切的可能性大致相當，如果跑膠再做放射自顯影的話，看到的會是DNA ladder 一樣的東西。但是，如果有蛋白與特定區域相結合，DNase I 無法酶切那一部分，我們看到的ladder 就會空缺一部分。這樣我們可以知道那一部分沒有被切到。這個實驗步驟其實不復雜，但是有些tricky，實驗的關鍵是DNase I 的用量和酶切時間。首先是做同位素標記探針的stock solution。stock solution 裡面除了探針以外，還加了非特異DNA,類似於poly(dI-dC) poly(dA-dT)之類的東西。
有一種成分引起了我的注意，聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol)。
這東東比較粘稠，為什麼要加它呢？大家想想看，用來做DNAase I footprinting assay 的樣品都是通過跑柱子的fractions，轉錄因子必定是被稀釋得很厲害的。足跡實驗最關鍵的就是要保證樣品蛋白和探針有充分的結合。聚乙烯醇性質就像一個\"分子海綿\"，占溶液體積不說，還跟蛋白質搶奪水分子，所以加入這個東東之後呢，蛋白質和探針的有效濃度都增大了，這樣有利於蛋白質和探針的相互結合。聚乙烯醇的作用原理跟PEG 很相似，第三個模塊的實驗裡面會用到PEG 沉澱。探針stock solution 配好之後，就是加我們純化出來的組分，孵育十幾分鐘。之後呢就是做DNAse I 酶切。我們這一組裡，我和丹麥女生負責做酶切，這個酶切可是把我們忙壞了。為什麼呢？酶切一共有三步，間隔時間很短。第一步是加Ca2+和Mg2+孵育一分鐘, 第二步是加DNase I 孵育一分鐘, 第三步是加反應中止液。我們是三個三個一做, 每20 秒加一個樣品, 這樣三分鐘三個樣品都完成了。丹麥女孩計時，然後我加樣品。可能是太緊張了把，我們連犯了兩次錯誤，漏加了Ca/Mg，只得重做幾個樣品。最後看結果的時候，我還特緊張，因為這是很重要的一份試驗數據，最後結果很不錯，還受了老師表揚，呵呵。
好了，第二模塊的實驗，到這裡就差不多了。這個培訓課兩星期的課程也進行了一半。
全體成員放假一天休息，而放假前一天晚上也沒有報告。我學校離CSH 很近，索性晚上就溜回去了，順便還把YL 硬拉出來聽我彙報學習心得，呵呵。
（十六）浮起來的細胞膜
休息了一整天，晚上全體學員和老師去一家sushi 店飽餐了一頓生魚片。第二天早上，第三個模塊的實驗開始了。老師是Sue-Hwa Lin， 這一個模塊是從大鼠肝髒裡面提取胰島素受體並且做一些鑒定。四個模塊的實驗之中，我最喜歡這個模塊。主要是因為這是唯一一個設計膜蛋白純化的實驗，而膜蛋白純化是所有蛋白質純化中最麻煩的一類。受體蛋白純化尤其麻煩，往往可能找不到又快又准確的測活辦法。胰島素受體即使溶解在去垢劑裡面也能與胰島素接合，所以用簡單的binding assay 就可以測活了。相比之下有些受體就不那麼好伺侯了，比如我研究的Notch 受體，配體也是膜蛋白，Notch 和配體必須都簇集在細胞表面或者固體表面才能有接合，溶液中的游離狀態下根本沒法相互作用。Sue-Hwa Lin 是一個好老師，喜歡在做實驗之前詳細給我們講解背景知識，這一點上她比其他三位老師都做得好。另外她的助手是一位台灣的中年婦女，在Sue-Hwa 實驗室做research assistant professor。這位助手特別nice，給我幫助很大。
好了，現在聊一聊純化的實驗步驟。首先是把大鼠肝髒的質膜部分分離出來，然後呢用去垢劑溶解一下，用凝集素層析來粗分一下組分，然後做受體測活與鑒定。大家可能注意到，最後純化出來的受體只是粗產品。事實上，手冊上這個實驗裡面還得做一步insulin affinity chromatography 來精製一下的。但是最近好多年，很多學員更希望做一些重組蛋白純化的實驗，所以就把原來的實驗給切短了。我覺得這種做法很不明智，因為重組蛋白純化的實驗實在不需要花幾千刀來冷泉港學的。
細胞膜結構的分離是一門大學問，著名的Methods in Enzymology 有專門的一輯整本都是講這個的。細胞膜結構主要有核膜，質膜，線粒體，內質網，高爾基體，溶酶體等等。其中核膜是最容易的，因為細胞核很重，稍微離心一下，就沉澱下來了。其它的膜結構中呢，線粒體是最重的，質膜由於有膽固醇成分，所以是最輕的。這兩種膜結構也是很好分開的。剩下的膜結構比重比較相似，所以不好分。
膜結構分離的方法呢，有很多種，但是變來變去，無非都是兩種基本方法的組合： 差速離心+蔗糖梯度離心。差速離心（differential centrifugation）是粗分膜結構的一種常用方法。
其實很簡單，就是用不同的速度離心三次。首先用等滲緩衝夜來做組織的勻漿，然後就開始離心。第一次是低速離心，只用600g，這麼小的離心力下，只有未破的細胞和細胞核才會沉澱下來。細胞主要的膜結構以及細胞質都還在上清裡面。拿上清再做第二次離心，這回離心力大了一個數量級，到了8000g。由於線粒體比其它膜結構要重一些，所以線粒體沉澱下來，而其它膜結構還在上清裡面。去上清進行第三次離心，這回離心力比前一次又要大一個數量級到了十萬g。所有的膜結構都會在此時沉澱下來，所以也包括質膜。需要強調的是，差速離心的分離是非常粗糙的，並不是十分乾淨。下一步的蔗糖梯度離心就要精細得多。但不管是什麼分離方法，本質上都不完美，千萬不要指望從某篇文章找到一個方法就能套用。
最好的辦法是利用細胞膜結構特徵性的一些標記物（比如plasma membrane, 測5\'nucleotidase 的活性)來分析分離方法的好壞，並加以改進。
我們分離質膜用的方法稍微特殊一點，省掉了差速離心這一步。這種方法對於分離大鼠肝臟質膜比較管用，對別的組織就不一定好用了。我們一組四個人，每人都分了一個新鮮冰凍的大鼠肝臟（解凍後很難聞），然後就是拿刀片剁啊剁。弄碎了之後就加一種低滲緩衝液，再把碎的肝臟和緩衝液倒到Dounce 勻漿器裡面做勻漿。勻漿用的緩衝液裡面加有Ca2+，比較重要。鈣離子能夠促進質膜碎片的聚集，這樣在1500g 這樣小的離心力下，質膜也能被沉澱下來。我們把勻漿用兩層cheese cloth 過濾，去掉了很多結締組織。然後就是用1500g 離心了。拿出離心管一看，果然有一個很鬆的pellet，包括了質膜，細胞核之類的東西。然後再把pellet 轉移到Dounce 勻漿器再弄均勻了。下面就開始準備蔗糖梯度離心(sucrose gradient)。蔗糖梯度離心是十分古老的一種方法，但直到現在還有很廣泛的應用。我們首先往pellet 勻漿裡面加69%的蔗糖溶液，一直到終濃度變為44%為止。蔗糖的濃度十分的重要，如果不準的話，根本就沒法分開。我們有一個折射儀，可以很快的測出溶液的折射率以及對應的蔗糖濃度。這個折射儀看起來很粗糙，但是卻十分好用。下一步呢，就是把加了蔗糖的勻漿轉移到超速離心管裡，然後在上層鋪一層42.3%的蔗糖溶液，接著就是超速離心兩小時（九萬g）。前面提到過，質膜相比其他膜結構而言是比較輕的，所以呢，在離心的過程中就會浮到上層來。我們吃罷午飯，就回來看離心管，果然看到一層棕色的東西浮在最上面。這層質膜看起來有點像果凍，可以用小勺舀出來。到這裡質膜的分離就算完成了。
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