(pH vs Temperature for Tris Buffer)
50 mM Tris Buffer的pH值
5°C 25°C 37°C
7.76 7.20 6.91
7.89 7.30 7.02
7.97 7.40 7.12
8.07 7.50 7.22
8.18 7.60 7.30
8.26 7.70 7.40
8.37 7.80 7.52
8.48 7.90 7.62
8.58 8.00 7.71
8.68 8.10 7.80
8.78 8.20 7.91
8.88 8.30 8.01
8.98 8.40 8.10
9.09 8.50 8.22
9.18 8.60 8.31
9.28 8.70 8.42
2009年7月24日 星期五
2009年6月12日 星期五
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-12
作者已不可考，如有人知道請告知
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（二十三）正相與反相
我們純化出鈣調蛋白之後，就開始進行一些蛋白質化學的分析。主要是蛋白酶消化，反相HPLC 分析，MALDI-TOF 質譜之類的分析。我覺得在這個課程裡面加一個質譜分析並不是那麼有用，因為基本上只是演示實驗，只是講了講皮毛而已。相比之下反相HPLC 在蛋白質純化中要重要得多。HPLC 的全稱是High Performance Liquid Chromatography （高效液相色譜），這個名稱聽起來好像很尖端的樣子，其實HPLC 組成部件非常簡單，主要是三部分，泵，柱子，和UV monitor。反相HPLC 跟一般的色譜的一個顯著不同是壓力。為了保證純化蛋白的分辨能力，反相HPLC 柱的matrix 材料顆粒非常精細，所以必須施加很大的壓力才能跑得動柱子。相比之下，反相HPLC 所需壓力比一般gel filration 柱子壓力大十倍都不止。反相HPLC 的分辨度十分驚人，遠遠超過其他色譜方法。分辨度高到什麼地步呢，我舉一個自己的例子。我原來在E.Coli 裡面表達EGF repeat，大概有7 到8KD 的樣子，然後用體外反應加上一個fucose 糖基。這個fucose 分子量只有146。就這麼小的區別，即使跑在SDS-PAGE 上也是看不出來的，但是用反相HPLC 可以很完全的把沒有糖基和修飾上糖基的EGF repeats 分成兩個峰。可見反相HPLC 有多麼強大了。
反相HPLC 雖然很強大，但是它最大的弱點是不能用來分離大的蛋白，只能用來分離小肽或者小蛋白（比如histone）。具體說起來，大於30KD 的蛋白就可能不行了。原因是洗脫相裡面用得是有機溶劑，容易使大蛋白，尤其是帶有很多二級結構的蛋白變性。
反相HPLC 為什麼叫反相(reverse phase)呢? 這其實跟正相(normal phase) HPLC 有關係。
正相HPLC 依靠提高流動相的極性來洗脫。而反相HPLC 則相反，依靠降低流動相的極性來洗脫。正相和反相HPLC 柱子的材料都是由silica gel（硅膠）構成的。反相HPLC 柱子的silica gel 上面還有衍生的alkyl group，所以疏水性強了許多。正相HPLC 一般用來分離脂類分子。脂類分子有少許極性，如果樣品溶解在有機溶劑裡面，再過柱的話，可以與柱子的silica gel 結合上。如果在流動相裡面逐漸提高極性成分，脂分子就會被洗脫下來。反相HPLC則是用來分離蛋白質的。蛋白質有部分疏水性質，過反相柱的時候，可以與silica gel 上的alkyl group 相互結合。但是如果在流動相裡面逐漸提高非極性成分（比如acetonitrile），蛋白質就會被洗脫下來。
大家可能注意到，反相HPLC 的原理和疏水作用層析的原理很相似。但是，反相HPLC裡面的蛋白質與柱子的疏水作用比一般疏水作用層析要強得多。原因就在於反相HPLC 流動相中含有TFA（三氟乙酸）。TFA 是一種強酸，所以能很有力質子化蛋白質中的羧基，是之不帶負電。同時又能與蛋白質中正電基團形成離子對，進一步增加蛋白質與柱材料的疏水相互作用。
反相HPLC 具體跑起來很簡單，主要是操作儀器，先把蛋白質樣品和0.1%TFA 的溶液混合一下，然後上樣，用0.1%TFA 衝洗若干分鐘，使得蛋白樣品和柱子結合上。然後逐漸增加流動相中的acetonitrle（乙晴）濃度，洗脫蛋白。
（二十四）尾聲
蛋白質純化第十三天，也就是最後一天的時候，大家基本上都鬆弛了下來，開始準備狂歡。先是每人發了一件紀念T shirt，然後在CSHL 的酒吧裡面開酒會，再接著就是龍蝦宴。
不過氣氛最熱烈的還是龍蝦宴之後的詩會。詩會我還是第一次碰到，要求每人寫一首跟蛋白質純化有關的詩，並且當眾朗讀，場面十分熱鬧和搞笑。我好不容易寫了一首，是這樣的：
My protein
My protein used to be wild,
Like a naughty child,
He likes to play seek and hide,
which makes me feel really tired,
But now I can find him no matter it is day or night,
Because from ***, Al, Sue-hwa and Constantin,
I have learned how to Purify!
詩會之後，絕大部分同學和老師都在活動室打乒乓球或者台球。而我由於住得近，就直接開車回學校了。回想起來，這一次的課程十分令人難忘，認識了很多新朋友，學到了很多新知識，大大開闊了眼界。當然，指望在短短的兩個星期就學會所有蛋白質純化的技術是很不現實的，但是這個課程至少讓我們認識到，蛋白質純化雖然很復雜，但是本身並不是那麼高不可攀。只要用心去揣摩和嘗試，就一定可以做得很好。
除了13 天的課程，寫這一系列學習筆記，也讓我收獲不小。因為寫的過程中，我認真的複習了所做實驗的記錄和課程的教材，對實驗設計的理解加深了好多。這也算是除了在BBS 上灌水外的一個意外收獲吧。
最後，如果有同學對蛋白質純化十分感興趣，我在此推薦兩本參考書。一本是我們這個課程的教材 Strategies for protein purification and characterization: a laboratory course manual .
Cold Spring Harbor laboratory Press。另一本是Methods in Enzymology. Vol 182, Guide to
Protein purification Academic Press.
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（二十三）正相與反相
我們純化出鈣調蛋白之後，就開始進行一些蛋白質化學的分析。主要是蛋白酶消化，反相HPLC 分析，MALDI-TOF 質譜之類的分析。我覺得在這個課程裡面加一個質譜分析並不是那麼有用，因為基本上只是演示實驗，只是講了講皮毛而已。相比之下反相HPLC 在蛋白質純化中要重要得多。HPLC 的全稱是High Performance Liquid Chromatography （高效液相色譜），這個名稱聽起來好像很尖端的樣子，其實HPLC 組成部件非常簡單，主要是三部分，泵，柱子，和UV monitor。反相HPLC 跟一般的色譜的一個顯著不同是壓力。為了保證純化蛋白的分辨能力，反相HPLC 柱的matrix 材料顆粒非常精細，所以必須施加很大的壓力才能跑得動柱子。相比之下，反相HPLC 所需壓力比一般gel filration 柱子壓力大十倍都不止。反相HPLC 的分辨度十分驚人，遠遠超過其他色譜方法。分辨度高到什麼地步呢，我舉一個自己的例子。我原來在E.Coli 裡面表達EGF repeat，大概有7 到8KD 的樣子，然後用體外反應加上一個fucose 糖基。這個fucose 分子量只有146。就這麼小的區別，即使跑在SDS-PAGE 上也是看不出來的，但是用反相HPLC 可以很完全的把沒有糖基和修飾上糖基的EGF repeats 分成兩個峰。可見反相HPLC 有多麼強大了。
反相HPLC 雖然很強大，但是它最大的弱點是不能用來分離大的蛋白，只能用來分離小肽或者小蛋白（比如histone）。具體說起來，大於30KD 的蛋白就可能不行了。原因是洗脫相裡面用得是有機溶劑，容易使大蛋白，尤其是帶有很多二級結構的蛋白變性。
反相HPLC 為什麼叫反相(reverse phase)呢? 這其實跟正相(normal phase) HPLC 有關係。
正相HPLC 依靠提高流動相的極性來洗脫。而反相HPLC 則相反，依靠降低流動相的極性來洗脫。正相和反相HPLC 柱子的材料都是由silica gel（硅膠）構成的。反相HPLC 柱子的silica gel 上面還有衍生的alkyl group，所以疏水性強了許多。正相HPLC 一般用來分離脂類分子。脂類分子有少許極性，如果樣品溶解在有機溶劑裡面，再過柱的話，可以與柱子的silica gel 結合上。如果在流動相裡面逐漸提高極性成分，脂分子就會被洗脫下來。反相HPLC則是用來分離蛋白質的。蛋白質有部分疏水性質，過反相柱的時候，可以與silica gel 上的alkyl group 相互結合。但是如果在流動相裡面逐漸提高非極性成分（比如acetonitrile），蛋白質就會被洗脫下來。
大家可能注意到，反相HPLC 的原理和疏水作用層析的原理很相似。但是，反相HPLC裡面的蛋白質與柱子的疏水作用比一般疏水作用層析要強得多。原因就在於反相HPLC 流動相中含有TFA（三氟乙酸）。TFA 是一種強酸，所以能很有力質子化蛋白質中的羧基，是之不帶負電。同時又能與蛋白質中正電基團形成離子對，進一步增加蛋白質與柱材料的疏水相互作用。
反相HPLC 具體跑起來很簡單，主要是操作儀器，先把蛋白質樣品和0.1%TFA 的溶液混合一下，然後上樣，用0.1%TFA 衝洗若干分鐘，使得蛋白樣品和柱子結合上。然後逐漸增加流動相中的acetonitrle（乙晴）濃度，洗脫蛋白。
（二十四）尾聲
蛋白質純化第十三天，也就是最後一天的時候，大家基本上都鬆弛了下來，開始準備狂歡。先是每人發了一件紀念T shirt，然後在CSHL 的酒吧裡面開酒會，再接著就是龍蝦宴。
不過氣氛最熱烈的還是龍蝦宴之後的詩會。詩會我還是第一次碰到，要求每人寫一首跟蛋白質純化有關的詩，並且當眾朗讀，場面十分熱鬧和搞笑。我好不容易寫了一首，是這樣的：
My protein
My protein used to be wild,
Like a naughty child,
He likes to play seek and hide,
which makes me feel really tired,
But now I can find him no matter it is day or night,
Because from ***, Al, Sue-hwa and Constantin,
I have learned how to Purify!
詩會之後，絕大部分同學和老師都在活動室打乒乓球或者台球。而我由於住得近，就直接開車回學校了。回想起來，這一次的課程十分令人難忘，認識了很多新朋友，學到了很多新知識，大大開闊了眼界。當然，指望在短短的兩個星期就學會所有蛋白質純化的技術是很不現實的，但是這個課程至少讓我們認識到，蛋白質純化雖然很復雜，但是本身並不是那麼高不可攀。只要用心去揣摩和嘗試，就一定可以做得很好。
除了13 天的課程，寫這一系列學習筆記，也讓我收獲不小。因為寫的過程中，我認真的複習了所做實驗的記錄和課程的教材，對實驗設計的理解加深了好多。這也算是除了在BBS 上灌水外的一個意外收獲吧。
最後，如果有同學對蛋白質純化十分感興趣，我在此推薦兩本參考書。一本是我們這個課程的教材 Strategies for protein purification and characterization: a laboratory course manual .
Cold Spring Harbor laboratory Press。另一本是Methods in Enzymology. Vol 182, Guide to
Protein purification Academic Press.
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-11
作者已不可考，如有人知道請告知
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（二十一）離子交換層析
做完硫酸銨沉澱以及等電點沉澱之後，下一步就是做離子交換層析(ion-exchange chromatography)。離子交換層析原理很簡單，利用蛋白質表面的帶電基團和resin上帶相反電荷的ion exchanger group 相互結合來純化蛋白。離子交換柱和affinity chromatography一樣，屬於absorption/desorption 型的層析方法，與gel filtration 完全不一樣，其中一個最大的優點
是，樣品體積可以很大，最後的洗脫樣品的體積可以小很多，這樣實際起到了一個濃縮樣品的作用。還有一個優點是，離子交換層析其實不需要柱子，可以用batch 的方法（在離心管裡面混合beads 和樣品）。當然如果beads 量多情況下，batch 方法平衡得不是很好，導致resolution 不是很好。這一點我們做實驗的時候深有體會，以後的一篇中我會提到。我們純化鈣調蛋白用了柱子做純化，原因是因為所用的beads 相當於Sephadex G50 再加上陰離子交換基團，所以實際上可以看成是ion-exchange 和gel filtration 的混合體。 Calmodulin 分子量比較小，所以很容易和分子量大的雜蛋白分開。
離子交換柱分為陽離子交換柱和陰離子交換柱，前者主要用來純化偏堿性的蛋白質，後者則用來純化偏酸性的蛋白質。絕大部分蛋白都偏酸性，所以陰離子交換柱用得更加普遍一些。常用的陽離子交換劑主要有Carboxymethyl 和sulfopropyl 兩種。Carboxymethyl 比sulfopropyl 要弱一些，所以同樣的蛋白與這兩種基團結合，後者的洗脫鹽濃度得高一些。常用的陰離子交換劑有DEAE(diethyl aminoehtyl)和Quaternary amine 兩種。後者比前者強，適用的pH 也更寬。選用何種離子交換劑要根據實際要純化蛋白的性質來決定。比如我們純化鈣調蛋白就用的是弱的陰離子交換柱DEAE，因為前面我提過，鈣調蛋白的pI 很低，蛋白很酸，與弱的陰離子交換劑也能結合得很好。而很多其它的雜蛋白沒有這麼酸，所以結合不上。這樣，用DEAE 實際上可以有效的除去很多雜質。
離子交換柱真正跑起來時非常簡單，沒有什麼技術含量，但是第一次純化一種蛋白的時
候，一定得先摸清起始條件。
首先要確定用什麼緩衝液。緩衝物由於自己帶電，所以也可以與ion-exchanger 結合。
這種結合會帶來兩方面的干擾，一個是降低了緩衝物的濃度，因而降低了緩衝能力，另一個是與蛋白質競爭ion-exchanger。所以呢，如果用陰離子交換柱， 要避免用磷酸buffer 之類的帶負電的緩衝物，如果用陽離子交換柱，則要避免用Tris buffer 之類的帶正電的緩衝物。有的緩衝物是兩性離子(zwitterionic)，比如HEPES，所以陰陽兩種離子交換層析都適用。如果待純化的蛋白是膜蛋白，要用去垢劑，則應該選用非離子型或者兩性離子型的去垢劑，道理跟上面是一樣的。
第二個要注意的起始條件是pH。有些時候要分離的蛋白的活性對pH 非常敏感，所以pH 沒有太多選擇。但很多情況，應該根據待純化蛋白的性質而進行選擇。以陰離子交換柱為例，如果蛋白結合得不好，可以提高一下pH,如果蛋白結合得太緊，需要高鹽洗脫的話，則應該降低一下pH。要確定最適合的pH，可以做一個簡單的小實驗（以陰離子交換柱為例）。配pH 從5.0 到9.0，間隔為0.5 的一系列緩衝液。用這些buffer 先把beads 平衡好了，然後向每一種pH 平衡好的beads 裡面加一小等分的樣品。孵育之後，取上清測活。如果蛋白質結合上去了，上清的活性就沒有了。然後，取比活性剛剛開始結合的pH 高0.5 單位的pH作為離子交換層析實驗的pH。注意，這裡pH 不是越高越好，pH 太高，雜蛋白也能結合上，會降低ion-exchanger 的capacity。確定了buffer 和pH, 下一步要確定的是上樣時的起始離子強度，也就是樣品起始鹽濃度。用來確定鹽濃度的小實驗是這麼做的，配一系列鹽濃度從0.1M 到1M（間隔0.1M)的緩衝液。用這些buffer 平衡 beads，然後加入一小等分的樣品，孵育之後，取上清測活。低鹽濃度下的上清應該沒有活性，因為蛋白可以與beads 結合，較高鹽濃度下, 上清中應開始出現活性。 然後選擇剛剛低於洗脫蛋白所需鹽濃度的濃度作為樣品的起始鹽濃度。這樣做的好處是, 一些與ionexchanger 結合較弱的雜蛋白，一開始就不會結合到beads 上去。另外，實際跑樣品之前，如果樣品體積比較大（比如數百毫升），必須測一下電導率以確定起始鹽濃度符合要求。如果低了，就應該加鹽，高了，就應該加水。
（二十二）失敗中的啟示
離子交換層析之後是最後一步純化，疏水作用層析(hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)。HIC 和硫酸銨沉澱是同一個原理。蛋白質表面有一些疏水區域，如果在蛋白質樣品溶液裡面加足夠的鹽，就會與這些疏水區域爭奪水分子。沒有了足夠的分子，這些疏水區域傾向於與其他疏水區域結合。HIC 的beads 上衍生有非極性基團，可以與蛋白質的疏水區域結合，這樣蛋白質就能bind 到柱子上。要想把蛋白質洗脫下來，則要用低鹽緩衝液衝洗，鹽濃度下降之後蛋白質與柱子的疏水相互作用也被削弱，所以能被衝洗下來。
由於HIC 要求樣品的起始鹽濃度很高，所以特別適於作為硫酸銨沉澱或者離子交換層析後續步驟。因為硫酸銨沉澱（無論是上清還是沉澱）和離子交換層析的產物，鹽濃度都非常高，如果直接再跑HIC，不但省了透析脫鹽的一步，還進一步純化了蛋白。現在常用的HIC resin上的疏水基團有兩種，一種是Phenyl 另一種是Octyl。比較而言，Octyl group 更加疏水一些。我們這一次的實驗中用的是Phenyl sepharose。值得強調的是，對於HIC 而言，resin 的衍生基團並不是越疏水就越好的。因為如果太疏水的話，與蛋白質的結合會十分緊密，以至於要加入有機溶劑，才能衝洗下來。但是有機溶劑同時又有可能使蛋白變性。疏水作用層析特別適用於純化鈣調蛋白。因為鈣調蛋白在有鈣離子結合的條件下，高度疏水，即使在低鹽濃度下也可以很牢固的與HIC column 結合。洗脫鈣調蛋白時，用含有EDTA 或者EGTA 的緩衝液。失去鈣離子的鈣調蛋白疏水性會降低很多, 這樣很容易被沖洗下來。
HIC 這一步，我感覺要比前一步離子交換有用的多。為什麼呢，這要從我們一組實驗中的失敗說起。跑DEAE 柱子需要我們自己裝柱，大小跟過去跑S-300 柱子差不多，裝好柱子之後我們就開始上樣。起初這個柱子沒什麼問題，但在樣品快要上完的時候，不知為何柱子裡面大量的beads 漏到了柱子的玻璃保溫夾層裡面。我們一看大事不好，只好把柱子停了，然後把beads 全掏了出來，准備用batch 的方法來洗脫蛋白。我們用了一個tissue culture 過濾media 的過濾器來做這件事情。beads 放在過濾漏鬥裡面，加含鹽的緩衝液攪拌洗滌，然後抽真空讓液體過濾出來。按道理，絕大部分鈣調蛋白應該被0.9M NaCl 的buffer 衝洗下來。
但是我們又發生了意外，衝洗的過程中過濾器被碰倒了，beads 和洗脫液撒了一桌子！眼看要成功了，竟然發生這種倒霉事情，全組人都很depressed，都有一種要就義的感覺。教員Constantin 比較有經驗，他要我們把0.9M NaCl 之前的低鹽洗脫液混在一起直接做下一步疏水作用層析。這樣一來，我們等於繞過了離子交換這一步。最後純化純化出來的蛋白讓我們大吃一驚，不但非常純不說，總量大概有幾十個毫克，跟手冊上給的通常產量差不多。這個結果說明一個問題，就是離子交換這一步雖然看起來很fancy，但對於鈣調蛋白的純化並不是那麼重要。蛋白質純化的步驟並不是越復雜越好，簡單，快速，便宜的步驟才是最好的。
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（二十一）離子交換層析
做完硫酸銨沉澱以及等電點沉澱之後，下一步就是做離子交換層析(ion-exchange chromatography)。離子交換層析原理很簡單，利用蛋白質表面的帶電基團和resin上帶相反電荷的ion exchanger group 相互結合來純化蛋白。離子交換柱和affinity chromatography一樣，屬於absorption/desorption 型的層析方法，與gel filtration 完全不一樣，其中一個最大的優點
是，樣品體積可以很大，最後的洗脫樣品的體積可以小很多，這樣實際起到了一個濃縮樣品的作用。還有一個優點是，離子交換層析其實不需要柱子，可以用batch 的方法（在離心管裡面混合beads 和樣品）。當然如果beads 量多情況下，batch 方法平衡得不是很好，導致resolution 不是很好。這一點我們做實驗的時候深有體會，以後的一篇中我會提到。我們純化鈣調蛋白用了柱子做純化，原因是因為所用的beads 相當於Sephadex G50 再加上陰離子交換基團，所以實際上可以看成是ion-exchange 和gel filtration 的混合體。 Calmodulin 分子量比較小，所以很容易和分子量大的雜蛋白分開。
離子交換柱分為陽離子交換柱和陰離子交換柱，前者主要用來純化偏堿性的蛋白質，後者則用來純化偏酸性的蛋白質。絕大部分蛋白都偏酸性，所以陰離子交換柱用得更加普遍一些。常用的陽離子交換劑主要有Carboxymethyl 和sulfopropyl 兩種。Carboxymethyl 比sulfopropyl 要弱一些，所以同樣的蛋白與這兩種基團結合，後者的洗脫鹽濃度得高一些。常用的陰離子交換劑有DEAE(diethyl aminoehtyl)和Quaternary amine 兩種。後者比前者強，適用的pH 也更寬。選用何種離子交換劑要根據實際要純化蛋白的性質來決定。比如我們純化鈣調蛋白就用的是弱的陰離子交換柱DEAE，因為前面我提過，鈣調蛋白的pI 很低，蛋白很酸，與弱的陰離子交換劑也能結合得很好。而很多其它的雜蛋白沒有這麼酸，所以結合不上。這樣，用DEAE 實際上可以有效的除去很多雜質。
離子交換柱真正跑起來時非常簡單，沒有什麼技術含量，但是第一次純化一種蛋白的時
候，一定得先摸清起始條件。
首先要確定用什麼緩衝液。緩衝物由於自己帶電，所以也可以與ion-exchanger 結合。
這種結合會帶來兩方面的干擾，一個是降低了緩衝物的濃度，因而降低了緩衝能力，另一個是與蛋白質競爭ion-exchanger。所以呢，如果用陰離子交換柱， 要避免用磷酸buffer 之類的帶負電的緩衝物，如果用陽離子交換柱，則要避免用Tris buffer 之類的帶正電的緩衝物。有的緩衝物是兩性離子(zwitterionic)，比如HEPES，所以陰陽兩種離子交換層析都適用。如果待純化的蛋白是膜蛋白，要用去垢劑，則應該選用非離子型或者兩性離子型的去垢劑，道理跟上面是一樣的。
第二個要注意的起始條件是pH。有些時候要分離的蛋白的活性對pH 非常敏感，所以pH 沒有太多選擇。但很多情況，應該根據待純化蛋白的性質而進行選擇。以陰離子交換柱為例，如果蛋白結合得不好，可以提高一下pH,如果蛋白結合得太緊，需要高鹽洗脫的話，則應該降低一下pH。要確定最適合的pH，可以做一個簡單的小實驗（以陰離子交換柱為例）。配pH 從5.0 到9.0，間隔為0.5 的一系列緩衝液。用這些buffer 先把beads 平衡好了，然後向每一種pH 平衡好的beads 裡面加一小等分的樣品。孵育之後，取上清測活。如果蛋白質結合上去了，上清的活性就沒有了。然後，取比活性剛剛開始結合的pH 高0.5 單位的pH作為離子交換層析實驗的pH。注意，這裡pH 不是越高越好，pH 太高，雜蛋白也能結合上，會降低ion-exchanger 的capacity。確定了buffer 和pH, 下一步要確定的是上樣時的起始離子強度，也就是樣品起始鹽濃度。用來確定鹽濃度的小實驗是這麼做的，配一系列鹽濃度從0.1M 到1M（間隔0.1M)的緩衝液。用這些buffer 平衡 beads，然後加入一小等分的樣品，孵育之後，取上清測活。低鹽濃度下的上清應該沒有活性，因為蛋白可以與beads 結合，較高鹽濃度下, 上清中應開始出現活性。 然後選擇剛剛低於洗脫蛋白所需鹽濃度的濃度作為樣品的起始鹽濃度。這樣做的好處是, 一些與ionexchanger 結合較弱的雜蛋白，一開始就不會結合到beads 上去。另外，實際跑樣品之前，如果樣品體積比較大（比如數百毫升），必須測一下電導率以確定起始鹽濃度符合要求。如果低了，就應該加鹽，高了，就應該加水。
（二十二）失敗中的啟示
離子交換層析之後是最後一步純化，疏水作用層析(hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)。HIC 和硫酸銨沉澱是同一個原理。蛋白質表面有一些疏水區域，如果在蛋白質樣品溶液裡面加足夠的鹽，就會與這些疏水區域爭奪水分子。沒有了足夠的分子，這些疏水區域傾向於與其他疏水區域結合。HIC 的beads 上衍生有非極性基團，可以與蛋白質的疏水區域結合，這樣蛋白質就能bind 到柱子上。要想把蛋白質洗脫下來，則要用低鹽緩衝液衝洗，鹽濃度下降之後蛋白質與柱子的疏水相互作用也被削弱，所以能被衝洗下來。
由於HIC 要求樣品的起始鹽濃度很高，所以特別適於作為硫酸銨沉澱或者離子交換層析後續步驟。因為硫酸銨沉澱（無論是上清還是沉澱）和離子交換層析的產物，鹽濃度都非常高，如果直接再跑HIC，不但省了透析脫鹽的一步，還進一步純化了蛋白。現在常用的HIC resin上的疏水基團有兩種，一種是Phenyl 另一種是Octyl。比較而言，Octyl group 更加疏水一些。我們這一次的實驗中用的是Phenyl sepharose。值得強調的是，對於HIC 而言，resin 的衍生基團並不是越疏水就越好的。因為如果太疏水的話，與蛋白質的結合會十分緊密，以至於要加入有機溶劑，才能衝洗下來。但是有機溶劑同時又有可能使蛋白變性。疏水作用層析特別適用於純化鈣調蛋白。因為鈣調蛋白在有鈣離子結合的條件下，高度疏水，即使在低鹽濃度下也可以很牢固的與HIC column 結合。洗脫鈣調蛋白時，用含有EDTA 或者EGTA 的緩衝液。失去鈣離子的鈣調蛋白疏水性會降低很多, 這樣很容易被沖洗下來。
HIC 這一步，我感覺要比前一步離子交換有用的多。為什麼呢，這要從我們一組實驗中的失敗說起。跑DEAE 柱子需要我們自己裝柱，大小跟過去跑S-300 柱子差不多，裝好柱子之後我們就開始上樣。起初這個柱子沒什麼問題，但在樣品快要上完的時候，不知為何柱子裡面大量的beads 漏到了柱子的玻璃保溫夾層裡面。我們一看大事不好，只好把柱子停了，然後把beads 全掏了出來，准備用batch 的方法來洗脫蛋白。我們用了一個tissue culture 過濾media 的過濾器來做這件事情。beads 放在過濾漏鬥裡面，加含鹽的緩衝液攪拌洗滌，然後抽真空讓液體過濾出來。按道理，絕大部分鈣調蛋白應該被0.9M NaCl 的buffer 衝洗下來。
但是我們又發生了意外，衝洗的過程中過濾器被碰倒了，beads 和洗脫液撒了一桌子！眼看要成功了，竟然發生這種倒霉事情，全組人都很depressed，都有一種要就義的感覺。教員Constantin 比較有經驗，他要我們把0.9M NaCl 之前的低鹽洗脫液混在一起直接做下一步疏水作用層析。這樣一來，我們等於繞過了離子交換這一步。最後純化純化出來的蛋白讓我們大吃一驚，不但非常純不說，總量大概有幾十個毫克，跟手冊上給的通常產量差不多。這個結果說明一個問題，就是離子交換這一步雖然看起來很fancy，但對於鈣調蛋白的純化並不是那麼重要。蛋白質純化的步驟並不是越復雜越好，簡單，快速，便宜的步驟才是最好的。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-10
作者已不可考，如有人知道請告知
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（十九）MDA-BF-1的啟示
凝集素層析實際操作起來很簡單，跟過簡單的Ni 柱子一樣。拿到洗脫的蛋白之後，我們就著手開始測活，分析純化的效率和倍數。胰島素受體不是酶，所以測活是利用胰島素與受體的特異結合。具體的測活步驟非常簡單，就是把I-125 標記的胰島素和純化的組分混合然後孵育一段時間。然後加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000 沉澱胰島素受體，而游離的胰島素不會被沉澱下來。說到PEG 沉澱，Dr.Lin 講了她自己鬧的一個笑話。是這樣的，她實驗室發現了一個蛋白質因子 MDA-BF-1。這個因子對Osteoblast（成骨細胞）的增長有促進作用。然後呢，她就想把這個因子的受體給找出來。首先一步呢，就是得有一個測活方法。
所以她就比照insulin receptor 的測活方法而設計了一個方法, 其中連PEG 沉澱都是一樣的。結果呢，這個測活試驗完全失敗了。問題出在PEG 沉澱這一步。PEG 作為一種多元醇，可以想像為一種“分子海綿”，可以吸附水分子。這樣樣品中蛋白的有效濃度實際變大了好多，容易出現聚集然後沉澱的現像。這就是為什麼insuline receptor 可以被沉澱下來的原因。而游離的胰島素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉澱不下來。而Dr. Lin 發現的MDA-BF-1 因子，分子量相對insulin 大了好多，有50 多KD，所以游離的因子也能被PEG 沉澱下來。聽完這個小插曲，我感覺挺吃驚，作為一個有經驗的教授，Dr.Lin 在沒弄清楚原理的情況下竟然就胡亂套用protocol 。所以呢，我感覺做實驗，僅僅是follow protocol 把實驗完成了，是遠遠不夠的。一定得搞清楚原理是怎麼回事，這樣出了問題才知道怎麼去改進。
MDA-BF-1 不僅僅給我以上的啟示。Dr.Lin 給我們做了一個seminar， 講述她的研究進展。其中她重點談到了MDA-BF-1 這個因子。 她實驗室現在正在做的是試圖用蛋白質純化的辦法來找出MDA-BF-1 的受體。她的測活方法是這樣的，首先表達MDA-BF1 的重組蛋白，然後用同位素標記，然後做binding assay。這個binding assay 很麻煩，因為沒辦法用簡單的手段把游離的MDA-BF-1 和與受體結合上的MDA-BF-1 分開，只能用gel filtration column 來分開，每做一次assay 都很麻煩。雖然Dr.Lin 提到她們還沒有找到那個受體，我個人覺得這個方法不是很明智。為什麼呢?純化蛋白的過程中，各種膜蛋白都處於一種被去垢劑溶解的勻漿狀態，這種情況下，一些正常生理條件下不會與MDA-BF1 結合的受體可能也會與其結合。 這樣一來，純化出來的東西就是亂七八糟的了。另外一種可能性是: 有很多膜蛋白能與MDA-BF-1 相互作用， 但是只有一種膜蛋白能夠啟動下游的信號傳導，促進Osteoblast 的增長。這種binding assay 的測活方法雖然可以找出與MDA-BF-1 結合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本沒有信號傳導的功能。需要強調的是，蛋白質純化絕對不是萬能的。要想純化出一個未知蛋白，最最重要的是要有一個簡單明了直接的測活方法。
Dr.Lin 實驗的問題，說到底，就是沒有好的測活方法。
這一個模塊的純化試驗到此就為止了。我們測活之後，比較了各種去垢劑的純化效率，發現Triton , CHAPS, Octyl Glucoside 都還比較好，Sodium Cholate 則差好多。原始的實驗手冊上還有進一步的insulin affinity chromatography 和其他分析。而教員為了滿足很多學生做做重組蛋白表達純化的願望，用一些比較白痴的的實驗取代了原有很經典的實驗。比如一個實驗是從SF9 裡面純化一個his tag 的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做這個試驗之後，幾乎要抓狂了。我這一組其他幾個人還把這個試驗當寶，搶著做。而我最後選擇去跑了一個2D gel。就這樣，第三個模塊的實驗結束了。
（二十）鈣調蛋白
純化胰島素受體的模塊結束之後，我們這一組人進入到最後一個模塊，做鈣調蛋白的純化和分析。鈣調蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細胞裡面都能找到。這個蛋白只有148 個氨基酸，大概16KD，比較小。有Ca2+結合的情況下，鈣調蛋白的構像可以發生較大的改變，從而激活一系列酶的活性，比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些protein kinases, phosphatases 和ATPase 等等。這一個模塊的實驗中，我們是從雞胗裡面提取和純化鈣調蛋白，然後再做一些分析。
這一個模塊的純化設計，可以說是最大限度的利用了鈣調蛋白的特殊性質，我覺得設計的很精彩。不過我對這個模塊的實驗經歷並不是很滿意。教員的實驗助手只有一個人，而且非常不稱職，對實驗本身似乎不太了解，也不是很helpful，感覺比前幾個模塊的實驗助手差多了。教員叫Constantin，是一個俄羅斯人，在rutgers 當教授。我起初對他印像不佳，後來發現這個人其實很nice,非常和藹。整個純化步驟大概是這樣的。首先把雞胗剁碎勻漿，然後做粗分離，用硫酸銨沉澱的辦法把雜蛋白都沉澱下來。然後再做等電點沉澱，把Calmodulin 沉澱下來。重溶沉澱之後再做透析來脫鹽。然後再過陰離子交換柱DEAE Sephadex A-50。純化出來的組分再過疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin 了，用Commassie blue 都可以染出來。我們做的實驗中沒有對Calmodulin 的測活實驗，可能是因為最後純化出來的Calmodulin很多,可以做光譜分析之類的實驗進行分析，所以就省掉了。但我多少有一點本末倒置的感覺。因為對未知蛋白質純化，首先就得有一個靠的住的測活方法, 然後才能逐漸制定最優化的純化策略。另外，在設計測活方法之前，還必須搞清楚，有生物活性的物質是不是蛋白質。
一般有下列幾種方法。(1)對protease 的是否敏感。(2)生物活性不會因為透析而丟掉(3)Urea之類的變性劑是否降低生物活性(4)對化學修飾劑(比如sulfur hydryl blocker idoacetamide)是
否敏感。
我們提取鈣調蛋白所用的組織原料，雞胗，量挺大的，有一斤之多，紅紅的一大堆肉。這樣的組織，勻漿是一件很麻煩的事情，所以我們用了一個大號的勻漿機，試圖把肉都搗爛。但是效果不好，重復了兩次，還是有很多肉沒有被弄碎，所以只好扔掉了。值得強調的是，對於這樣大量組織的勻漿，緩衝液的配方必須有所考慮。首先，離子強度要低一點，高離子強度容易導致蛋白質聚集和沉澱；其次，最好加如EDTA 之類金屬離子螯合劑。這是因為組織裡面會有很多二價陽離子，有可能會與組織裡面的一些無機鹽（比如磷酸鹽）反應產生沉澱，導致勻漿中蛋白質不能完全溶解。最後，如果要在後續步驟中過陽離子交換柱，要避免有primary amine 的緩衝物（比如tris），如果要過陰離子交換柱，則要避免用磷酸buffer。我們拿到勻漿之後，然後過濾。接著的一步就是硫酸銨沉澱。硫酸銨沉澱的原理我前面提到過，所以就不多說了。我們用了飽和硫酸銨濃度（６０％）來沉澱。鈣調蛋白這個東東很奇怪，沒有鈣離子結合的情況下很親水，所以即使用飽和硫酸銨，也沉澱不下來。但大量的雜蛋白都能被沉澱下來。當然也不是所有的雜蛋白，至少血紅蛋白就不行，因為硫酸銨沉澱後的上清還是紅色的。下一步呢，就是等電點沉澱。鈣調蛋白是一個很酸的蛋白，等電點只有4.05，所以可以加硫酸使pH 降到4.05 附近，蛋白總電荷為零，就容易聚集沉澱。我的感覺是，等電點沉澱並不是很可靠的方法，因為很難保證沉澱過程中蛋白會不會變性。搞不好，蛋白沉澱後就沒法重溶了。鈣調蛋白溶解性比較好，也比較皮實，重溶起來比較容易。
重溶用的是Tris 的溶液，由於這個時候樣品溶液裡面鹽濃度很高，不能直接上樣到下一步的離子交換柱上，所以需要透析。我們先把樣品放到蒸餾水中透析兩三個小時，然後再換到一般的緩衝液裡。透析大家估計都熟悉，也沒有什麼技術含量。只有兩點值得注意，首先，透析袋不能裝滿，因為透析過程中樣品體積會增加。其次，透析袋空的地方要弄癟，不能留空氣，否則樣品體積增大後，扎緊的透析袋可能會受壓而破裂。
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（十九）MDA-BF-1的啟示
凝集素層析實際操作起來很簡單，跟過簡單的Ni 柱子一樣。拿到洗脫的蛋白之後，我們就著手開始測活，分析純化的效率和倍數。胰島素受體不是酶，所以測活是利用胰島素與受體的特異結合。具體的測活步驟非常簡單，就是把I-125 標記的胰島素和純化的組分混合然後孵育一段時間。然後加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000 沉澱胰島素受體，而游離的胰島素不會被沉澱下來。說到PEG 沉澱，Dr.Lin 講了她自己鬧的一個笑話。是這樣的，她實驗室發現了一個蛋白質因子 MDA-BF-1。這個因子對Osteoblast（成骨細胞）的增長有促進作用。然後呢，她就想把這個因子的受體給找出來。首先一步呢，就是得有一個測活方法。
所以她就比照insulin receptor 的測活方法而設計了一個方法, 其中連PEG 沉澱都是一樣的。結果呢，這個測活試驗完全失敗了。問題出在PEG 沉澱這一步。PEG 作為一種多元醇，可以想像為一種“分子海綿”，可以吸附水分子。這樣樣品中蛋白的有效濃度實際變大了好多，容易出現聚集然後沉澱的現像。這就是為什麼insuline receptor 可以被沉澱下來的原因。而游離的胰島素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉澱不下來。而Dr. Lin 發現的MDA-BF-1 因子，分子量相對insulin 大了好多，有50 多KD，所以游離的因子也能被PEG 沉澱下來。聽完這個小插曲，我感覺挺吃驚，作為一個有經驗的教授，Dr.Lin 在沒弄清楚原理的情況下竟然就胡亂套用protocol 。所以呢，我感覺做實驗，僅僅是follow protocol 把實驗完成了，是遠遠不夠的。一定得搞清楚原理是怎麼回事，這樣出了問題才知道怎麼去改進。
MDA-BF-1 不僅僅給我以上的啟示。Dr.Lin 給我們做了一個seminar， 講述她的研究進展。其中她重點談到了MDA-BF-1 這個因子。 她實驗室現在正在做的是試圖用蛋白質純化的辦法來找出MDA-BF-1 的受體。她的測活方法是這樣的，首先表達MDA-BF1 的重組蛋白，然後用同位素標記，然後做binding assay。這個binding assay 很麻煩，因為沒辦法用簡單的手段把游離的MDA-BF-1 和與受體結合上的MDA-BF-1 分開，只能用gel filtration column 來分開，每做一次assay 都很麻煩。雖然Dr.Lin 提到她們還沒有找到那個受體，我個人覺得這個方法不是很明智。為什麼呢?純化蛋白的過程中，各種膜蛋白都處於一種被去垢劑溶解的勻漿狀態，這種情況下，一些正常生理條件下不會與MDA-BF1 結合的受體可能也會與其結合。 這樣一來，純化出來的東西就是亂七八糟的了。另外一種可能性是: 有很多膜蛋白能與MDA-BF-1 相互作用， 但是只有一種膜蛋白能夠啟動下游的信號傳導，促進Osteoblast 的增長。這種binding assay 的測活方法雖然可以找出與MDA-BF-1 結合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本沒有信號傳導的功能。需要強調的是，蛋白質純化絕對不是萬能的。要想純化出一個未知蛋白，最最重要的是要有一個簡單明了直接的測活方法。
Dr.Lin 實驗的問題，說到底，就是沒有好的測活方法。
這一個模塊的純化試驗到此就為止了。我們測活之後，比較了各種去垢劑的純化效率，發現Triton , CHAPS, Octyl Glucoside 都還比較好，Sodium Cholate 則差好多。原始的實驗手冊上還有進一步的insulin affinity chromatography 和其他分析。而教員為了滿足很多學生做做重組蛋白表達純化的願望，用一些比較白痴的的實驗取代了原有很經典的實驗。比如一個實驗是從SF9 裡面純化一個his tag 的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做這個試驗之後，幾乎要抓狂了。我這一組其他幾個人還把這個試驗當寶，搶著做。而我最後選擇去跑了一個2D gel。就這樣，第三個模塊的實驗結束了。
（二十）鈣調蛋白
純化胰島素受體的模塊結束之後，我們這一組人進入到最後一個模塊，做鈣調蛋白的純化和分析。鈣調蛋白(Calmodulin)十分重要，幾乎在所有真核細胞裡面都能找到。這個蛋白只有148 個氨基酸，大概16KD，比較小。有Ca2+結合的情況下，鈣調蛋白的構像可以發生較大的改變，從而激活一系列酶的活性，比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些protein kinases, phosphatases 和ATPase 等等。這一個模塊的實驗中，我們是從雞胗裡面提取和純化鈣調蛋白，然後再做一些分析。
這一個模塊的純化設計，可以說是最大限度的利用了鈣調蛋白的特殊性質，我覺得設計的很精彩。不過我對這個模塊的實驗經歷並不是很滿意。教員的實驗助手只有一個人，而且非常不稱職，對實驗本身似乎不太了解，也不是很helpful，感覺比前幾個模塊的實驗助手差多了。教員叫Constantin，是一個俄羅斯人，在rutgers 當教授。我起初對他印像不佳，後來發現這個人其實很nice,非常和藹。整個純化步驟大概是這樣的。首先把雞胗剁碎勻漿，然後做粗分離，用硫酸銨沉澱的辦法把雜蛋白都沉澱下來。然後再做等電點沉澱，把Calmodulin 沉澱下來。重溶沉澱之後再做透析來脫鹽。然後再過陰離子交換柱DEAE Sephadex A-50。純化出來的組分再過疏水作用層析柱，就可以得到很純的Calmodulin 了，用Commassie blue 都可以染出來。我們做的實驗中沒有對Calmodulin 的測活實驗，可能是因為最後純化出來的Calmodulin很多,可以做光譜分析之類的實驗進行分析，所以就省掉了。但我多少有一點本末倒置的感覺。因為對未知蛋白質純化，首先就得有一個靠的住的測活方法, 然後才能逐漸制定最優化的純化策略。另外，在設計測活方法之前，還必須搞清楚，有生物活性的物質是不是蛋白質。
一般有下列幾種方法。(1)對protease 的是否敏感。(2)生物活性不會因為透析而丟掉(3)Urea之類的變性劑是否降低生物活性(4)對化學修飾劑(比如sulfur hydryl blocker idoacetamide)是
否敏感。
我們提取鈣調蛋白所用的組織原料，雞胗，量挺大的，有一斤之多，紅紅的一大堆肉。這樣的組織，勻漿是一件很麻煩的事情，所以我們用了一個大號的勻漿機，試圖把肉都搗爛。但是效果不好，重復了兩次，還是有很多肉沒有被弄碎，所以只好扔掉了。值得強調的是，對於這樣大量組織的勻漿，緩衝液的配方必須有所考慮。首先，離子強度要低一點，高離子強度容易導致蛋白質聚集和沉澱；其次，最好加如EDTA 之類金屬離子螯合劑。這是因為組織裡面會有很多二價陽離子，有可能會與組織裡面的一些無機鹽（比如磷酸鹽）反應產生沉澱，導致勻漿中蛋白質不能完全溶解。最後，如果要在後續步驟中過陽離子交換柱，要避免有primary amine 的緩衝物（比如tris），如果要過陰離子交換柱，則要避免用磷酸buffer。我們拿到勻漿之後，然後過濾。接著的一步就是硫酸銨沉澱。硫酸銨沉澱的原理我前面提到過，所以就不多說了。我們用了飽和硫酸銨濃度（６０％）來沉澱。鈣調蛋白這個東東很奇怪，沒有鈣離子結合的情況下很親水，所以即使用飽和硫酸銨，也沉澱不下來。但大量的雜蛋白都能被沉澱下來。當然也不是所有的雜蛋白，至少血紅蛋白就不行，因為硫酸銨沉澱後的上清還是紅色的。下一步呢，就是等電點沉澱。鈣調蛋白是一個很酸的蛋白，等電點只有4.05，所以可以加硫酸使pH 降到4.05 附近，蛋白總電荷為零，就容易聚集沉澱。我的感覺是，等電點沉澱並不是很可靠的方法，因為很難保證沉澱過程中蛋白會不會變性。搞不好，蛋白沉澱後就沒法重溶了。鈣調蛋白溶解性比較好，也比較皮實，重溶起來比較容易。
重溶用的是Tris 的溶液，由於這個時候樣品溶液裡面鹽濃度很高，不能直接上樣到下一步的離子交換柱上，所以需要透析。我們先把樣品放到蒸餾水中透析兩三個小時，然後再換到一般的緩衝液裡。透析大家估計都熟悉，也沒有什麼技術含量。只有兩點值得注意，首先，透析袋不能裝滿，因為透析過程中樣品體積會增加。其次，透析袋空的地方要弄癟，不能留空氣，否則樣品體積增大後，扎緊的透析袋可能會受壓而破裂。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-9
作者已不可考，如有人知道請告知
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（十七）何去何從
上一章提到從大鼠肝臟提取質膜的方法。質膜準備好了，下一步就得考慮怎麼溶解質膜。
最主要的問題是：用什麼去垢劑呢？Dr.Lin 在這一步試驗裡面要求每一組中的四個人各選一種去垢劑來溶解質膜，純化完之後再比較不同去垢劑的蛋白質純化效率，看看哪一種去垢劑最有效。選擇去垢劑很簡單，無非是想讓膜蛋白能被充分的溶解解離下來，同時又不使蛋白變性。事實上，純化膜蛋白時去垢劑的選擇是沒有規律可循，除了一些顯而易見的不適合做純化的去垢劑(比如SDS)外，很難講什麼去垢劑好什麼去垢劑不好。所以，只能具體問題具體分析，一個一個去嘗試。我們這一組人選的四種去垢劑分別是: Triton X100, Sodium Cholate,Chaps, 和Octyl glucoside。我選的是Octyl Glucoside。
好了，我先來講講去垢劑的小常識。去垢劑其實是很大一門學問，我幾年前就花過好多力氣來學習其中的一些知識，但到現在為止還是只懂了一些皮毛。這裡就權當拋磚引玉了。
首先，什麼是去垢劑(detergent)呢？就是同時具有疏水和親水兩種基團的化合物。雖然脂類化合物也有類似性質，但是去垢劑能夠形成膠束(micelle)，所以相比之下非常易於在水中溶解。去垢劑的疏水基團一般是下面三種(1)直鏈或者支鏈烷基結構(2)類固醇之類的多元環結構(3)取代苯基結構(比如大家常用的Triton X100 或者NP40)。去垢劑的親水基團一般有(1)羧酸基團，比如膽酸鈉(sodium cholate) (2)兩性離子基團, 比如CHAPS (3)糖類衍生物,比如Octyl glucoside, (4)聚乙氧乙醇基團, 比如Triton X-100 和NP-40。 Triton X100 和NP40 大家都用得比較多。它們實際上是同一種去垢劑，疏水基團是取代苯基，而親水基團是聚乙氧乙醇基團。我想強調的一點是，聚乙氧乙醇基團與氧氣很容易發生反應形成過氧化物, 如果用在蛋白質純化裡面，很有可能會破壞蛋白質的活性。所以一般商業化的,比較純的NP-40和Triton X-100 都是小包裝，而且在包裝瓶子裡面充有惰性氣體。
選擇適當去垢劑來純化膜蛋白，有一些實際問題必須先想好。我強烈建議大家以後選擇
和使用去垢劑的時候先考慮以下幾個問題：
(1)選擇的去垢劑是否干擾蛋白質濃度的測定？
類似於Triton X100 之類的去垢劑有苯環結構，所以在280nm 有很強的吸收。而相比之下CHAPS 和膽酸鈉之類的去垢劑就沒有這個問題。另外，有些去垢劑會嚴重的干擾一些protein assay。比如常用的Bradford assay，用的是commassie blue G-250 染料。這種染料在酸性條件下呈現為褐色膠體物質，但在與疏水物質結合之後會變得穩定而呈現藍色。所以可以想見，這種染料不單能染蛋白質，也能染一些去垢劑。我們在實驗一開始專門做了測試，發現Triton X100 和sodium cholate 對Bradford assay 干擾比較嚴重，chaps, 尤其是Octyl glucoside 基本上沒有什麼干擾。遇到這種干擾問題，要麼換去垢劑，要麼換protein assay 方法。
(2)是否需要在以後的步驟裡面去掉或者置換掉去垢劑？
去掉或者置換掉去垢劑是一件很麻煩的事情。因為很多去垢劑會形成膠束結構，分子量非常大，所以沒法用簡單的透析或者超濾來去掉。比如大家常用的Triton X100 和NP40, 單體分子量是628,膠束的單體聚集數是140, 所以膠束的分子量有87KD 了,這顯然是沒有辦法用透析來去掉的。相比之下CHAPS 單體分子量615,聚集數是10, 膠束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。
(3)是否需要在以後的步驟裡面用到離子交換層析或者疏水作用層析？
離子型去垢劑會與相應離子交換柱結合得很好，干擾蛋白質的純化。所以如果要用到離子交換柱，要用非離子型或者兩性離子型的去垢劑。另外，由於去垢劑有疏水基團，一般用了去垢劑之後，就不應該在後續步驟裡采用疏水作用層析的方法了。
(4)如果在後續步驟中選用凝集素層析, 選用的去垢劑是否構成干擾？
凝集素是一種植物中提取的一系列可以與糖基結合的蛋白。因為很多膜蛋白都有糖基修飾，凝集素層析可以利用這種性質來純化一些膜蛋白。類似與Octyl Glucoside 的去垢劑，親水基團是糖或者糖的衍生物，有可能與凝集素結合，降低凝集素的純化效果。比如ConA agarose 常常被用來純化具有High-mannose type N-glycan 的蛋白質，與mannose 和glucose都能結合。如果此時用Octyl glucoside，就無法純化蛋白了，因為Octyl glucoside 的親水基團是一個glucose。
(5)是否需要用弱的去垢劑來去掉soluble protein?
有時候用去垢劑並非完全是用來溶解膜蛋百，其實也可以用來去掉一些可溶蛋白雜質。比如Sodium cholate 是一種很弱的去垢劑，雖然不能用來很有效的溶解insulin receptor 之類的膜蛋白, 但是可是用來處理plasma membrane prep, 去掉大量的可溶蛋白雜質。
(6)是否需要用去垢劑來做Two phase partitioning？
Triton X114 是一種很特別的去垢劑，在室溫下很容易溶解在水中，但是在３０攝氏度以上會從水相中脫離出來，並且連帶的把膜蛋白也一起拽出來。這樣呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分開。這種方法叫做，two phase partitioning。我並不太喜歡這種方法，因為有一組人做了這個實驗，感覺分得並不是那麼乾淨，在可溶相還是有不少insulin receptor。
(7)去垢劑的用量是否足夠?
要充分的溶解膜蛋白，去垢劑的用量必須足夠才行。我們在試驗中，先測了一下起始樣品的蛋白總濃度，然後以detergent : protein 5:1 的比例加去垢劑。
(8)選用的去垢劑是否影響所純化蛋白的活性？
有些情況下，某些十分嬌貴的蛋白質對一些去垢劑很敏感。問題是，很難預先就知道那種去垢劑會降低蛋白活性。但是，我覺得大家至少得意識到，去垢劑很有可能干擾蛋白活性的。我舉一個例子。我是做糖基轉移酶的。有一種酶叫Protein O-mannosyltransferase 1 是一種膜蛋白，跟muscular dystrophy 有關系，是一個研究熱點。很多實驗室都懷疑這種蛋白是糖基轉移酶，但是很長一段時間裡面，很多實驗室發現表達的重組蛋白都沒有活性。一直到前兩年，終於有一個實驗室證明了這個蛋白是有活性的。之所以很多實驗室之前都不成功，其中一個重要因素就是去垢劑。Triton X100 和NP40 是很常用的去垢劑。這個成功的實驗室發現，如果用常規濃度下的Triton X-100，表達的Protein O-mannosyltransferase 完全沒有活性，相比之下用了Octyl thio-glucoside 就有活性了！所以呢，如果大家試圖表達一個膜蛋白，卻沒有活性，不妨換一下去垢劑，說不定會有意外的驚喜。
（十八）凝集素層析
我們用去垢劑溶解了膜蛋白之後，緊跟著的一步就是用Wheat Germ Aglutinin(WGA) agarose 來部分純化insulin receptor。WGA 是凝集素(Lectin）中的一種，而Lectin 指的是可以與糖基結合的蛋白質。現在常用來做蛋白質純化的凝集素絕大部分是從植物中提取出來的。絕大部分膜蛋白的extracellular domain 和分泌蛋白都有N-linked glycan 的糖基修飾。根據這個性質，用固定有適當的凝集素的beads，比如WGA agarose 或者ConA agarose 可以部分提純膜蛋白。注意，只能是部分提純，凝集素層析並不能一步登天，讓蛋白質比活力一下子提高上千倍，至多幾十倍就已經很不錯了。但儘管如此，凝集素層析是一種很好的辦法，因為buffer 條件非常溫和，洗脫液是加了糖的buffer，透析什麼的也方便，非常非常適合於和其他層析方法偶連起來用。
純化膜蛋白用的最主要的兩種凝集素是WGA 和ConA。談到這裡，我先向大家介紹一下N-linked glycans。N-linked glycans 是哺乳動物細胞中最常見的一種糖基修飾。這種糖基是加在膜蛋白的extracellular domain 上面。如果膜蛋白有這個sequence, N-X-S/T，最前面的Asparagine 多半被N-glycan 修飾。N-glycan 是一個Oligosaccharide 結構，好像一個分叉的樹枝一樣。膜蛋白的新生肽鏈在被翻譯合成的同時會被直接塞入ER lumen，同時就會被加上一整個樹枝狀的N-glycan core。這個N-glycan 加上去之後，並不是就大功告成了，而是要經歷一系列“裁減”，有的糖基會被去掉，新的糖基又會被加上，這樣最後的N-glycan structure 往往是千奇百怪。 但是N-glycan 的“主幹”都是相似的。
Man Man
\\ /
\\Man/
|
GlcNAc
|
GlcNAc
|
N-X-S/T
Man 代表Mannose 甘露糖，而GlcNAc 代表N-乙酰葡萄糖胺。
保留在ER 或者Cis-Golgi 的膜蛋白,N-glycan 往往是High-mannose type。在這種N-glycan的末端有很多甘露糖(mannose)修飾。最適合於純化這種蛋白的凝集素是ConA。ConA 主要識別alpha-mannose, alpha-glucose 和alpha-GlcNAc,所以可以這三種糖溶液來做洗脫液。分泌出去的蛋白，或者已經到細胞表面的膜蛋白的N-glycan 往往是complex type。這種complextype N-glycan 的末端往往修飾有Sialic acid（唾液酸，一種帶負電的糖）和GlcNAc。而WGA主要識別GlcNAc 和Sialic acids，所以特別適合於純化這種類型的蛋白，洗脫液可以用GlcNAc 和Sialic acid 溶液。
最後需要指出來是，純化一種特定蛋白，選擇用什麼凝集素是完全經驗性的，需要提前測試才知道的。
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（十七）何去何從
上一章提到從大鼠肝臟提取質膜的方法。質膜準備好了，下一步就得考慮怎麼溶解質膜。
最主要的問題是：用什麼去垢劑呢？Dr.Lin 在這一步試驗裡面要求每一組中的四個人各選一種去垢劑來溶解質膜，純化完之後再比較不同去垢劑的蛋白質純化效率，看看哪一種去垢劑最有效。選擇去垢劑很簡單，無非是想讓膜蛋白能被充分的溶解解離下來，同時又不使蛋白變性。事實上，純化膜蛋白時去垢劑的選擇是沒有規律可循，除了一些顯而易見的不適合做純化的去垢劑(比如SDS)外，很難講什麼去垢劑好什麼去垢劑不好。所以，只能具體問題具體分析，一個一個去嘗試。我們這一組人選的四種去垢劑分別是: Triton X100, Sodium Cholate,Chaps, 和Octyl glucoside。我選的是Octyl Glucoside。
好了，我先來講講去垢劑的小常識。去垢劑其實是很大一門學問，我幾年前就花過好多力氣來學習其中的一些知識，但到現在為止還是只懂了一些皮毛。這裡就權當拋磚引玉了。
首先，什麼是去垢劑(detergent)呢？就是同時具有疏水和親水兩種基團的化合物。雖然脂類化合物也有類似性質，但是去垢劑能夠形成膠束(micelle)，所以相比之下非常易於在水中溶解。去垢劑的疏水基團一般是下面三種(1)直鏈或者支鏈烷基結構(2)類固醇之類的多元環結構(3)取代苯基結構(比如大家常用的Triton X100 或者NP40)。去垢劑的親水基團一般有(1)羧酸基團，比如膽酸鈉(sodium cholate) (2)兩性離子基團, 比如CHAPS (3)糖類衍生物,比如Octyl glucoside, (4)聚乙氧乙醇基團, 比如Triton X-100 和NP-40。 Triton X100 和NP40 大家都用得比較多。它們實際上是同一種去垢劑，疏水基團是取代苯基，而親水基團是聚乙氧乙醇基團。我想強調的一點是，聚乙氧乙醇基團與氧氣很容易發生反應形成過氧化物, 如果用在蛋白質純化裡面，很有可能會破壞蛋白質的活性。所以一般商業化的,比較純的NP-40和Triton X-100 都是小包裝，而且在包裝瓶子裡面充有惰性氣體。
選擇適當去垢劑來純化膜蛋白，有一些實際問題必須先想好。我強烈建議大家以後選擇
和使用去垢劑的時候先考慮以下幾個問題：
(1)選擇的去垢劑是否干擾蛋白質濃度的測定？
類似於Triton X100 之類的去垢劑有苯環結構，所以在280nm 有很強的吸收。而相比之下CHAPS 和膽酸鈉之類的去垢劑就沒有這個問題。另外，有些去垢劑會嚴重的干擾一些protein assay。比如常用的Bradford assay，用的是commassie blue G-250 染料。這種染料在酸性條件下呈現為褐色膠體物質，但在與疏水物質結合之後會變得穩定而呈現藍色。所以可以想見，這種染料不單能染蛋白質，也能染一些去垢劑。我們在實驗一開始專門做了測試，發現Triton X100 和sodium cholate 對Bradford assay 干擾比較嚴重，chaps, 尤其是Octyl glucoside 基本上沒有什麼干擾。遇到這種干擾問題，要麼換去垢劑，要麼換protein assay 方法。
(2)是否需要在以後的步驟裡面去掉或者置換掉去垢劑？
去掉或者置換掉去垢劑是一件很麻煩的事情。因為很多去垢劑會形成膠束結構，分子量非常大，所以沒法用簡單的透析或者超濾來去掉。比如大家常用的Triton X100 和NP40, 單體分子量是628,膠束的單體聚集數是140, 所以膠束的分子量有87KD 了,這顯然是沒有辦法用透析來去掉的。相比之下CHAPS 單體分子量615,聚集數是10, 膠束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。
(3)是否需要在以後的步驟裡面用到離子交換層析或者疏水作用層析？
離子型去垢劑會與相應離子交換柱結合得很好，干擾蛋白質的純化。所以如果要用到離子交換柱，要用非離子型或者兩性離子型的去垢劑。另外，由於去垢劑有疏水基團，一般用了去垢劑之後，就不應該在後續步驟裡采用疏水作用層析的方法了。
(4)如果在後續步驟中選用凝集素層析, 選用的去垢劑是否構成干擾？
凝集素是一種植物中提取的一系列可以與糖基結合的蛋白。因為很多膜蛋白都有糖基修飾，凝集素層析可以利用這種性質來純化一些膜蛋白。類似與Octyl Glucoside 的去垢劑，親水基團是糖或者糖的衍生物，有可能與凝集素結合，降低凝集素的純化效果。比如ConA agarose 常常被用來純化具有High-mannose type N-glycan 的蛋白質，與mannose 和glucose都能結合。如果此時用Octyl glucoside，就無法純化蛋白了，因為Octyl glucoside 的親水基團是一個glucose。
(5)是否需要用弱的去垢劑來去掉soluble protein?
有時候用去垢劑並非完全是用來溶解膜蛋百，其實也可以用來去掉一些可溶蛋白雜質。比如Sodium cholate 是一種很弱的去垢劑，雖然不能用來很有效的溶解insulin receptor 之類的膜蛋白, 但是可是用來處理plasma membrane prep, 去掉大量的可溶蛋白雜質。
(6)是否需要用去垢劑來做Two phase partitioning？
Triton X114 是一種很特別的去垢劑，在室溫下很容易溶解在水中，但是在３０攝氏度以上會從水相中脫離出來，並且連帶的把膜蛋白也一起拽出來。這樣呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分開。這種方法叫做，two phase partitioning。我並不太喜歡這種方法，因為有一組人做了這個實驗，感覺分得並不是那麼乾淨，在可溶相還是有不少insulin receptor。
(7)去垢劑的用量是否足夠?
要充分的溶解膜蛋白，去垢劑的用量必須足夠才行。我們在試驗中，先測了一下起始樣品的蛋白總濃度，然後以detergent : protein 5:1 的比例加去垢劑。
(8)選用的去垢劑是否影響所純化蛋白的活性？
有些情況下，某些十分嬌貴的蛋白質對一些去垢劑很敏感。問題是，很難預先就知道那種去垢劑會降低蛋白活性。但是，我覺得大家至少得意識到，去垢劑很有可能干擾蛋白活性的。我舉一個例子。我是做糖基轉移酶的。有一種酶叫Protein O-mannosyltransferase 1 是一種膜蛋白，跟muscular dystrophy 有關系，是一個研究熱點。很多實驗室都懷疑這種蛋白是糖基轉移酶，但是很長一段時間裡面，很多實驗室發現表達的重組蛋白都沒有活性。一直到前兩年，終於有一個實驗室證明了這個蛋白是有活性的。之所以很多實驗室之前都不成功，其中一個重要因素就是去垢劑。Triton X100 和NP40 是很常用的去垢劑。這個成功的實驗室發現，如果用常規濃度下的Triton X-100，表達的Protein O-mannosyltransferase 完全沒有活性，相比之下用了Octyl thio-glucoside 就有活性了！所以呢，如果大家試圖表達一個膜蛋白，卻沒有活性，不妨換一下去垢劑，說不定會有意外的驚喜。
（十八）凝集素層析
我們用去垢劑溶解了膜蛋白之後，緊跟著的一步就是用Wheat Germ Aglutinin(WGA) agarose 來部分純化insulin receptor。WGA 是凝集素(Lectin）中的一種，而Lectin 指的是可以與糖基結合的蛋白質。現在常用來做蛋白質純化的凝集素絕大部分是從植物中提取出來的。絕大部分膜蛋白的extracellular domain 和分泌蛋白都有N-linked glycan 的糖基修飾。根據這個性質，用固定有適當的凝集素的beads，比如WGA agarose 或者ConA agarose 可以部分提純膜蛋白。注意，只能是部分提純，凝集素層析並不能一步登天，讓蛋白質比活力一下子提高上千倍，至多幾十倍就已經很不錯了。但儘管如此，凝集素層析是一種很好的辦法，因為buffer 條件非常溫和，洗脫液是加了糖的buffer，透析什麼的也方便，非常非常適合於和其他層析方法偶連起來用。
純化膜蛋白用的最主要的兩種凝集素是WGA 和ConA。談到這裡，我先向大家介紹一下N-linked glycans。N-linked glycans 是哺乳動物細胞中最常見的一種糖基修飾。這種糖基是加在膜蛋白的extracellular domain 上面。如果膜蛋白有這個sequence, N-X-S/T，最前面的Asparagine 多半被N-glycan 修飾。N-glycan 是一個Oligosaccharide 結構，好像一個分叉的樹枝一樣。膜蛋白的新生肽鏈在被翻譯合成的同時會被直接塞入ER lumen，同時就會被加上一整個樹枝狀的N-glycan core。這個N-glycan 加上去之後，並不是就大功告成了，而是要經歷一系列“裁減”，有的糖基會被去掉，新的糖基又會被加上，這樣最後的N-glycan structure 往往是千奇百怪。 但是N-glycan 的“主幹”都是相似的。
Man Man
\\ /
\\Man/
|
GlcNAc
|
GlcNAc
|
N-X-S/T
Man 代表Mannose 甘露糖，而GlcNAc 代表N-乙酰葡萄糖胺。
保留在ER 或者Cis-Golgi 的膜蛋白,N-glycan 往往是High-mannose type。在這種N-glycan的末端有很多甘露糖(mannose)修飾。最適合於純化這種蛋白的凝集素是ConA。ConA 主要識別alpha-mannose, alpha-glucose 和alpha-GlcNAc,所以可以這三種糖溶液來做洗脫液。分泌出去的蛋白，或者已經到細胞表面的膜蛋白的N-glycan 往往是complex type。這種complextype N-glycan 的末端往往修飾有Sialic acid（唾液酸，一種帶負電的糖）和GlcNAc。而WGA主要識別GlcNAc 和Sialic acids，所以特別適合於純化這種類型的蛋白，洗脫液可以用GlcNAc 和Sialic acid 溶液。
最後需要指出來是，純化一種特定蛋白，選擇用什麼凝集素是完全經驗性的，需要提前測試才知道的。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-8
作者已不可考，如有人知道請告知
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（十五）AP1的活性測定
第二個模塊的實驗，DNA affinity chromatography 之後我們又跑了一個更精細的Gel filtration，用的是Amersham 賣的Superose 6 預裝柱子。純化步驟就只有這麼多了。剩下的就是一些活性測定。無論是sephacryl 分出來的組分還是DNA affinity column 分出來的組分，我們都測試了AP1 的活性。方法呢就只有兩種，一種是凝膠遷移率變動分析(EMSA)，另一種是DNA 水解酶I 足跡分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用來分析蛋白與特定DNA的結合能力。我過去沒做過這兩種實驗，所以感覺很新奇，做的也格外賣力，結果也還不錯。
Gel Mobility-shift assay 原理很簡單，把蛋白質樣品和P32 標記的寡聚核苷酸探針一起孵育十幾分鐘, 然後拿去跑一個低濃度acrylamide 膠。如果探針結合上蛋白了，速度會變慢很多，就會停滯在膠的上段；如果沒有結合上，探針就會自由的跑到膠的下段去。然後把膠拿去做放射自顯影就行了。跑膠的裝置塊頭挺大的，是用來跑DNA 測序膠的裝置。把兩大塊玻璃板和兩片spacer 夾起來之後，instructor 先做一個gel plug，就是配少量gel 溶液，然後加過量的TEMED，然後迅速加到玻璃板中間，這些膠還沒漏完就會凝固，所以會封住底端。
這是一個小竅門，據instructor 講，這個方法雖然很粗糙，但是比其他任何封底的辦法都管
用。還有一個小竅門。是這樣的，由於膠的濃度低，比較脆弱，另外尺寸比較大。跑完如果把一塊玻璃板從膠上拿開的話，膠的某些部分會分別粘在兩個玻璃板上，這樣取膠的時候就很容易把整個膠弄破。我們做膠的時候，指導老師要我們把一塊玻璃板的貼著膠的一面硅化（用sigmacote, 成分是氯化有機硅氧烷) 一下，使得這一面比較疏水，就不會與膠粘在一起了。這樣打開膠夾層的時候,膠只會緊緊貼在一面玻璃上面，把膠和這整塊玻璃拿去放射自顯影就行了。生物實驗要想令人心服口服，沒有對照是不行的。EMSA 也不例外。陽性對照很簡單，是看看系統能不能work。關鍵是陰性對照，來看蛋白質與探針的結合是否特異。
EMSA 的陰性對照有兩種，一種呢，是用來看和探針的結合的蛋白是不是特異的某一種蛋白。做法很簡單，就是蛋白質和探針孵育的同時加入抗那種蛋白的抗體，抗體識別蛋白質之後會形成更大的protein complex,在膠看起來就是探針的遷移率進一步降低了。這叫\"supershift\"。另一種對照呢，是看蛋白質與探針的結合是不是與探針序列有關，因為如果是非特異性的結合，純化就沒有意義了。這種對照也很簡單，在蛋白質與探針孵育的同時，加入沒有同位素標記的探針來競爭。如果加入完全同序列的競爭DNA 可以削弱protein-DNA interaction， 一兩個nucleotide 不一樣就無法削弱的話， 說明看到的探針與蛋白質的結合是跟探針序列緊密相關的。我們在實驗中用了第二種control, 效果挺驚人，僅僅是兩個nucleotide 和探針不一樣，競爭DNA 探針就沒法work 了。
Gel Mobility-shift assay 雖然能夠證明一段Oligos 是否能和蛋白質結合，卻還是不能告訴我們該蛋白質到底與哪一小段的序列直接接觸。DNAase I footprinting assay 正是用來解決這個問題的。DNase I 可以隨機的分解DNA，正常情況下，一段DNA 探針各處被酶切的可能性大致相當，如果跑膠再做放射自顯影的話，看到的會是DNA ladder 一樣的東西。但是，如果有蛋白與特定區域相結合，DNase I 無法酶切那一部分，我們看到的ladder 就會空缺一部分。這樣我們可以知道那一部分沒有被切到。這個實驗步驟其實不復雜，但是有些tricky，實驗的關鍵是DNase I 的用量和酶切時間。首先是做同位素標記探針的stock solution。stock solution 裡面除了探針以外，還加了非特異DNA,類似於poly(dI-dC) poly(dA-dT)之類的東西。
有一種成分引起了我的注意，聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol)。
這東東比較粘稠，為什麼要加它呢？大家想想看，用來做DNAase I footprinting assay 的樣品都是通過跑柱子的fractions，轉錄因子必定是被稀釋得很厲害的。足跡實驗最關鍵的就是要保證樣品蛋白和探針有充分的結合。聚乙烯醇性質就像一個\"分子海綿\"，占溶液體積不說，還跟蛋白質搶奪水分子，所以加入這個東東之後呢，蛋白質和探針的有效濃度都增大了，這樣有利於蛋白質和探針的相互結合。聚乙烯醇的作用原理跟PEG 很相似，第三個模塊的實驗裡面會用到PEG 沉澱。探針stock solution 配好之後，就是加我們純化出來的組分，孵育十幾分鐘。之後呢就是做DNAse I 酶切。我們這一組裡，我和丹麥女生負責做酶切，這個酶切可是把我們忙壞了。為什麼呢？酶切一共有三步，間隔時間很短。第一步是加Ca2+和Mg2+孵育一分鐘, 第二步是加DNase I 孵育一分鐘, 第三步是加反應中止液。我們是三個三個一做, 每20 秒加一個樣品, 這樣三分鐘三個樣品都完成了。丹麥女孩計時，然後我加樣品。可能是太緊張了把，我們連犯了兩次錯誤，漏加了Ca/Mg，只得重做幾個樣品。最後看結果的時候，我還特緊張，因為這是很重要的一份試驗數據，最後結果很不錯，還受了老師表揚，呵呵。
好了，第二模塊的實驗，到這裡就差不多了。這個培訓課兩星期的課程也進行了一半。
全體成員放假一天休息，而放假前一天晚上也沒有報告。我學校離CSH 很近，索性晚上就溜回去了，順便還把YL 硬拉出來聽我彙報學習心得，呵呵。
（十六）浮起來的細胞膜
休息了一整天，晚上全體學員和老師去一家sushi 店飽餐了一頓生魚片。第二天早上，第三個模塊的實驗開始了。老師是Sue-Hwa Lin， 這一個模塊是從大鼠肝髒裡面提取胰島素受體並且做一些鑒定。四個模塊的實驗之中，我最喜歡這個模塊。主要是因為這是唯一一個設計膜蛋白純化的實驗，而膜蛋白純化是所有蛋白質純化中最麻煩的一類。受體蛋白純化尤其麻煩，往往可能找不到又快又准確的測活辦法。胰島素受體即使溶解在去垢劑裡面也能與胰島素接合，所以用簡單的binding assay 就可以測活了。相比之下有些受體就不那麼好伺侯了，比如我研究的Notch 受體，配體也是膜蛋白，Notch 和配體必須都簇集在細胞表面或者固體表面才能有接合，溶液中的游離狀態下根本沒法相互作用。Sue-Hwa Lin 是一個好老師，喜歡在做實驗之前詳細給我們講解背景知識，這一點上她比其他三位老師都做得好。另外她的助手是一位台灣的中年婦女，在Sue-Hwa 實驗室做research assistant professor。這位助手特別nice，給我幫助很大。
好了，現在聊一聊純化的實驗步驟。首先是把大鼠肝髒的質膜部分分離出來，然後呢用去垢劑溶解一下，用凝集素層析來粗分一下組分，然後做受體測活與鑒定。大家可能注意到，最後純化出來的受體只是粗產品。事實上，手冊上這個實驗裡面還得做一步insulin affinity chromatography 來精製一下的。但是最近好多年，很多學員更希望做一些重組蛋白純化的實驗，所以就把原來的實驗給切短了。我覺得這種做法很不明智，因為重組蛋白純化的實驗實在不需要花幾千刀來冷泉港學的。
細胞膜結構的分離是一門大學問，著名的Methods in Enzymology 有專門的一輯整本都是講這個的。細胞膜結構主要有核膜，質膜，線粒體，內質網，高爾基體，溶酶體等等。其中核膜是最容易的，因為細胞核很重，稍微離心一下，就沉澱下來了。其它的膜結構中呢，線粒體是最重的，質膜由於有膽固醇成分，所以是最輕的。這兩種膜結構也是很好分開的。剩下的膜結構比重比較相似，所以不好分。
膜結構分離的方法呢，有很多種，但是變來變去，無非都是兩種基本方法的組合： 差速離心+蔗糖梯度離心。差速離心（differential centrifugation）是粗分膜結構的一種常用方法。
其實很簡單，就是用不同的速度離心三次。首先用等滲緩衝夜來做組織的勻漿，然後就開始離心。第一次是低速離心，只用600g，這麼小的離心力下，只有未破的細胞和細胞核才會沉澱下來。細胞主要的膜結構以及細胞質都還在上清裡面。拿上清再做第二次離心，這回離心力大了一個數量級，到了8000g。由於線粒體比其它膜結構要重一些，所以線粒體沉澱下來，而其它膜結構還在上清裡面。去上清進行第三次離心，這回離心力比前一次又要大一個數量級到了十萬g。所有的膜結構都會在此時沉澱下來，所以也包括質膜。需要強調的是，差速離心的分離是非常粗糙的，並不是十分乾淨。下一步的蔗糖梯度離心就要精細得多。但不管是什麼分離方法，本質上都不完美，千萬不要指望從某篇文章找到一個方法就能套用。
最好的辦法是利用細胞膜結構特徵性的一些標記物（比如plasma membrane, 測5\'nucleotidase 的活性)來分析分離方法的好壞，並加以改進。
我們分離質膜用的方法稍微特殊一點，省掉了差速離心這一步。這種方法對於分離大鼠肝臟質膜比較管用，對別的組織就不一定好用了。我們一組四個人，每人都分了一個新鮮冰凍的大鼠肝臟（解凍後很難聞），然後就是拿刀片剁啊剁。弄碎了之後就加一種低滲緩衝液，再把碎的肝臟和緩衝液倒到Dounce 勻漿器裡面做勻漿。勻漿用的緩衝液裡面加有Ca2+，比較重要。鈣離子能夠促進質膜碎片的聚集，這樣在1500g 這樣小的離心力下，質膜也能被沉澱下來。我們把勻漿用兩層cheese cloth 過濾，去掉了很多結締組織。然後就是用1500g 離心了。拿出離心管一看，果然有一個很鬆的pellet，包括了質膜，細胞核之類的東西。然後再把pellet 轉移到Dounce 勻漿器再弄均勻了。下面就開始準備蔗糖梯度離心(sucrose gradient)。蔗糖梯度離心是十分古老的一種方法，但直到現在還有很廣泛的應用。我們首先往pellet 勻漿裡面加69%的蔗糖溶液，一直到終濃度變為44%為止。蔗糖的濃度十分的重要，如果不準的話，根本就沒法分開。我們有一個折射儀，可以很快的測出溶液的折射率以及對應的蔗糖濃度。這個折射儀看起來很粗糙，但是卻十分好用。下一步呢，就是把加了蔗糖的勻漿轉移到超速離心管裡，然後在上層鋪一層42.3%的蔗糖溶液，接著就是超速離心兩小時（九萬g）。前面提到過，質膜相比其他膜結構而言是比較輕的，所以呢，在離心的過程中就會浮到上層來。我們吃罷午飯，就回來看離心管，果然看到一層棕色的東西浮在最上面。這層質膜看起來有點像果凍，可以用小勺舀出來。到這裡質膜的分離就算完成了。
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（十五）AP1的活性測定
第二個模塊的實驗，DNA affinity chromatography 之後我們又跑了一個更精細的Gel filtration，用的是Amersham 賣的Superose 6 預裝柱子。純化步驟就只有這麼多了。剩下的就是一些活性測定。無論是sephacryl 分出來的組分還是DNA affinity column 分出來的組分，我們都測試了AP1 的活性。方法呢就只有兩種，一種是凝膠遷移率變動分析(EMSA)，另一種是DNA 水解酶I 足跡分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用來分析蛋白與特定DNA的結合能力。我過去沒做過這兩種實驗，所以感覺很新奇，做的也格外賣力，結果也還不錯。
Gel Mobility-shift assay 原理很簡單，把蛋白質樣品和P32 標記的寡聚核苷酸探針一起孵育十幾分鐘, 然後拿去跑一個低濃度acrylamide 膠。如果探針結合上蛋白了，速度會變慢很多，就會停滯在膠的上段；如果沒有結合上，探針就會自由的跑到膠的下段去。然後把膠拿去做放射自顯影就行了。跑膠的裝置塊頭挺大的，是用來跑DNA 測序膠的裝置。把兩大塊玻璃板和兩片spacer 夾起來之後，instructor 先做一個gel plug，就是配少量gel 溶液，然後加過量的TEMED，然後迅速加到玻璃板中間，這些膠還沒漏完就會凝固，所以會封住底端。
這是一個小竅門，據instructor 講，這個方法雖然很粗糙，但是比其他任何封底的辦法都管
用。還有一個小竅門。是這樣的，由於膠的濃度低，比較脆弱，另外尺寸比較大。跑完如果把一塊玻璃板從膠上拿開的話，膠的某些部分會分別粘在兩個玻璃板上，這樣取膠的時候就很容易把整個膠弄破。我們做膠的時候，指導老師要我們把一塊玻璃板的貼著膠的一面硅化（用sigmacote, 成分是氯化有機硅氧烷) 一下，使得這一面比較疏水，就不會與膠粘在一起了。這樣打開膠夾層的時候,膠只會緊緊貼在一面玻璃上面，把膠和這整塊玻璃拿去放射自顯影就行了。生物實驗要想令人心服口服，沒有對照是不行的。EMSA 也不例外。陽性對照很簡單，是看看系統能不能work。關鍵是陰性對照，來看蛋白質與探針的結合是否特異。
EMSA 的陰性對照有兩種，一種呢，是用來看和探針的結合的蛋白是不是特異的某一種蛋白。做法很簡單，就是蛋白質和探針孵育的同時加入抗那種蛋白的抗體，抗體識別蛋白質之後會形成更大的protein complex,在膠看起來就是探針的遷移率進一步降低了。這叫\"supershift\"。另一種對照呢，是看蛋白質與探針的結合是不是與探針序列有關，因為如果是非特異性的結合，純化就沒有意義了。這種對照也很簡單，在蛋白質與探針孵育的同時，加入沒有同位素標記的探針來競爭。如果加入完全同序列的競爭DNA 可以削弱protein-DNA interaction， 一兩個nucleotide 不一樣就無法削弱的話， 說明看到的探針與蛋白質的結合是跟探針序列緊密相關的。我們在實驗中用了第二種control, 效果挺驚人，僅僅是兩個nucleotide 和探針不一樣，競爭DNA 探針就沒法work 了。
Gel Mobility-shift assay 雖然能夠證明一段Oligos 是否能和蛋白質結合，卻還是不能告訴我們該蛋白質到底與哪一小段的序列直接接觸。DNAase I footprinting assay 正是用來解決這個問題的。DNase I 可以隨機的分解DNA，正常情況下，一段DNA 探針各處被酶切的可能性大致相當，如果跑膠再做放射自顯影的話，看到的會是DNA ladder 一樣的東西。但是，如果有蛋白與特定區域相結合，DNase I 無法酶切那一部分，我們看到的ladder 就會空缺一部分。這樣我們可以知道那一部分沒有被切到。這個實驗步驟其實不復雜，但是有些tricky，實驗的關鍵是DNase I 的用量和酶切時間。首先是做同位素標記探針的stock solution。stock solution 裡面除了探針以外，還加了非特異DNA,類似於poly(dI-dC) poly(dA-dT)之類的東西。
有一種成分引起了我的注意，聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol)。
這東東比較粘稠，為什麼要加它呢？大家想想看，用來做DNAase I footprinting assay 的樣品都是通過跑柱子的fractions，轉錄因子必定是被稀釋得很厲害的。足跡實驗最關鍵的就是要保證樣品蛋白和探針有充分的結合。聚乙烯醇性質就像一個\"分子海綿\"，占溶液體積不說，還跟蛋白質搶奪水分子，所以加入這個東東之後呢，蛋白質和探針的有效濃度都增大了，這樣有利於蛋白質和探針的相互結合。聚乙烯醇的作用原理跟PEG 很相似，第三個模塊的實驗裡面會用到PEG 沉澱。探針stock solution 配好之後，就是加我們純化出來的組分，孵育十幾分鐘。之後呢就是做DNAse I 酶切。我們這一組裡，我和丹麥女生負責做酶切，這個酶切可是把我們忙壞了。為什麼呢？酶切一共有三步，間隔時間很短。第一步是加Ca2+和Mg2+孵育一分鐘, 第二步是加DNase I 孵育一分鐘, 第三步是加反應中止液。我們是三個三個一做, 每20 秒加一個樣品, 這樣三分鐘三個樣品都完成了。丹麥女孩計時，然後我加樣品。可能是太緊張了把，我們連犯了兩次錯誤，漏加了Ca/Mg，只得重做幾個樣品。最後看結果的時候，我還特緊張，因為這是很重要的一份試驗數據，最後結果很不錯，還受了老師表揚，呵呵。
好了，第二模塊的實驗，到這裡就差不多了。這個培訓課兩星期的課程也進行了一半。
全體成員放假一天休息，而放假前一天晚上也沒有報告。我學校離CSH 很近，索性晚上就溜回去了，順便還把YL 硬拉出來聽我彙報學習心得，呵呵。
（十六）浮起來的細胞膜
休息了一整天，晚上全體學員和老師去一家sushi 店飽餐了一頓生魚片。第二天早上，第三個模塊的實驗開始了。老師是Sue-Hwa Lin， 這一個模塊是從大鼠肝髒裡面提取胰島素受體並且做一些鑒定。四個模塊的實驗之中，我最喜歡這個模塊。主要是因為這是唯一一個設計膜蛋白純化的實驗，而膜蛋白純化是所有蛋白質純化中最麻煩的一類。受體蛋白純化尤其麻煩，往往可能找不到又快又准確的測活辦法。胰島素受體即使溶解在去垢劑裡面也能與胰島素接合，所以用簡單的binding assay 就可以測活了。相比之下有些受體就不那麼好伺侯了，比如我研究的Notch 受體，配體也是膜蛋白，Notch 和配體必須都簇集在細胞表面或者固體表面才能有接合，溶液中的游離狀態下根本沒法相互作用。Sue-Hwa Lin 是一個好老師，喜歡在做實驗之前詳細給我們講解背景知識，這一點上她比其他三位老師都做得好。另外她的助手是一位台灣的中年婦女，在Sue-Hwa 實驗室做research assistant professor。這位助手特別nice，給我幫助很大。
好了，現在聊一聊純化的實驗步驟。首先是把大鼠肝髒的質膜部分分離出來，然後呢用去垢劑溶解一下，用凝集素層析來粗分一下組分，然後做受體測活與鑒定。大家可能注意到，最後純化出來的受體只是粗產品。事實上，手冊上這個實驗裡面還得做一步insulin affinity chromatography 來精製一下的。但是最近好多年，很多學員更希望做一些重組蛋白純化的實驗，所以就把原來的實驗給切短了。我覺得這種做法很不明智，因為重組蛋白純化的實驗實在不需要花幾千刀來冷泉港學的。
細胞膜結構的分離是一門大學問，著名的Methods in Enzymology 有專門的一輯整本都是講這個的。細胞膜結構主要有核膜，質膜，線粒體，內質網，高爾基體，溶酶體等等。其中核膜是最容易的，因為細胞核很重，稍微離心一下，就沉澱下來了。其它的膜結構中呢，線粒體是最重的，質膜由於有膽固醇成分，所以是最輕的。這兩種膜結構也是很好分開的。剩下的膜結構比重比較相似，所以不好分。
膜結構分離的方法呢，有很多種，但是變來變去，無非都是兩種基本方法的組合： 差速離心+蔗糖梯度離心。差速離心（differential centrifugation）是粗分膜結構的一種常用方法。
其實很簡單，就是用不同的速度離心三次。首先用等滲緩衝夜來做組織的勻漿，然後就開始離心。第一次是低速離心，只用600g，這麼小的離心力下，只有未破的細胞和細胞核才會沉澱下來。細胞主要的膜結構以及細胞質都還在上清裡面。拿上清再做第二次離心，這回離心力大了一個數量級，到了8000g。由於線粒體比其它膜結構要重一些，所以線粒體沉澱下來，而其它膜結構還在上清裡面。去上清進行第三次離心，這回離心力比前一次又要大一個數量級到了十萬g。所有的膜結構都會在此時沉澱下來，所以也包括質膜。需要強調的是，差速離心的分離是非常粗糙的，並不是十分乾淨。下一步的蔗糖梯度離心就要精細得多。但不管是什麼分離方法，本質上都不完美，千萬不要指望從某篇文章找到一個方法就能套用。
最好的辦法是利用細胞膜結構特徵性的一些標記物（比如plasma membrane, 測5\'nucleotidase 的活性)來分析分離方法的好壞，並加以改進。
我們分離質膜用的方法稍微特殊一點，省掉了差速離心這一步。這種方法對於分離大鼠肝臟質膜比較管用，對別的組織就不一定好用了。我們一組四個人，每人都分了一個新鮮冰凍的大鼠肝臟（解凍後很難聞），然後就是拿刀片剁啊剁。弄碎了之後就加一種低滲緩衝液，再把碎的肝臟和緩衝液倒到Dounce 勻漿器裡面做勻漿。勻漿用的緩衝液裡面加有Ca2+，比較重要。鈣離子能夠促進質膜碎片的聚集，這樣在1500g 這樣小的離心力下，質膜也能被沉澱下來。我們把勻漿用兩層cheese cloth 過濾，去掉了很多結締組織。然後就是用1500g 離心了。拿出離心管一看，果然有一個很鬆的pellet，包括了質膜，細胞核之類的東西。然後再把pellet 轉移到Dounce 勻漿器再弄均勻了。下面就開始準備蔗糖梯度離心(sucrose gradient)。蔗糖梯度離心是十分古老的一種方法，但直到現在還有很廣泛的應用。我們首先往pellet 勻漿裡面加69%的蔗糖溶液，一直到終濃度變為44%為止。蔗糖的濃度十分的重要，如果不準的話，根本就沒法分開。我們有一個折射儀，可以很快的測出溶液的折射率以及對應的蔗糖濃度。這個折射儀看起來很粗糙，但是卻十分好用。下一步呢，就是把加了蔗糖的勻漿轉移到超速離心管裡，然後在上層鋪一層42.3%的蔗糖溶液，接著就是超速離心兩小時（九萬g）。前面提到過，質膜相比其他膜結構而言是比較輕的，所以呢，在離心的過程中就會浮到上層來。我們吃罷午飯，就回來看離心管，果然看到一層棕色的東西浮在最上面。這層質膜看起來有點像果凍，可以用小勺舀出來。到這裡質膜的分離就算完成了。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-7
作者已不可考，如有人知道請告知
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（十三）裝柱子的學問
上篇提到了Gel filtration 的基本原理，現在談談我裝柱子的過程。我們用的是Amersham的 XK26/40 的空柱子，然後往裡面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理說，要提高分辨率，柱子應該是越長越細才好，這種柱子雖然不短，但是挺粗的。但是一個好處就是，樣品體積可以大一些。
裝柱子本身就是一件很tricky 的事情，以致於這課的教程上專門列了一小節來解釋怎麼裝柱子。我們這一組人中，我負責裝柱子。一開始就是洗resin 了，用粗制燒結玻板過濾的漏斗來洗，感覺這方法還挺快的。洗完了，就把resin 重懸成50%的slurry，然後就是往柱子裡頭倒了。但是呢，有一個小竅門，就是必須先封閉柱子的下出口，往柱子裡面倒10%體積的buffer。我過去裝柱子犯傻，不知道要這麼做，結果發現下面的resin 不均勻不說，還有一大堆氣泡。所以先加buffer 是很必要的。倒slurry 的時候還得用玻棒引流，這樣可以儘可能的避免氣泡。然後就是等了，等resin 沉降３０分鐘後，就可以打開柱子的下出液口，讓多餘的緩衝液流出去。液面低到靠近柱面的時候呢，就可以把上端液流接頭接到柱子上方。
這個過程最麻煩了，主要是不能引入氣泡，所以先得讓這個接頭裝置裡面充滿緩衝液，把氣泡趕出來。我第一次做沒經驗，費了九牛二虎之力才搞定了。然後就是接上蠕動泵(peristaltic pump) 加壓，讓resin 繼續緊縮一下。隨著柱面的下降，接頭裝置還得不斷往下移動，使得接頭剛剛好與柱面接觸。接觸不緊密的話，等於是衝淡了樣品，分辨率會降低。
柱子裝好了，但還不能開始跑樣品。為什麼呢？因為這種柱子的質量必須很好才能達到分離蛋白的效果，否則是根本沒法work 的。所以呢，首先得測試這個柱子是否真的裝好了。測試過程很簡單，就是跑一下藍色葡聚糖(blue dextran)，藍色葡聚糖是帶有藍色染料的多糖高分子聚合體，體積非常大，所以在空體積(void volume)就會洗脫出來。跑藍色葡聚糖可以達到三個目的。第一個就是確定void volume，知道這個空體積是很重要的。因為每次裝柱子，實際resin 的總體積都會有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脫體積與空體積的比值是一定的，所以只要知道了空體積，就能知道蛋白大概會在什麼時候洗脫出來。第二個就是確定樣品會被稀釋多少。第三個呢，是柱子是否裝的均勻。如果裝的不均勻，葡聚糖就會跑得形狀怪異。一般來說呢，柱子下端堆積會比上端均勻，為了分辨度好，應該從更均勻的一端上樣。所以我們在做的時候，是從下端上樣的。忙活了半天，當所有裝置都裝好的時候，感覺還是挺興奮的。首先是蠕動泵，然後是柱子，然後是UV monitor 加記錄儀。整套裝置不貴，功能卻很齊全。
（十四）anfinsen的疑慮
跑完sephacryl 柱子，組分就可以過DNA affinity column。DNA affinity column 雖然很重要，但是這一步技術上來說要求很低。買來CNBR 活化好的agarose，然後讓特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最簡單便宜的一次性柱子。親合層析是目前最常用也最強大的一種蛋白質純化技術, 純化效率比別的層析方法可以高出一兩個數量級。這種方法誕生是六十年代的事情。當時是在NIH 的Anfinsen 實驗室。
Anfinsen 是一個諾貝爾獎獲得者，可以說是蛋白質折疊研究的老祖宗。他主要貢獻是通過研究ribonuclease 的變性和重折疊證明氨基酸序列就可以決定蛋白質最後的三維結構。他實驗室那時侯有一個學生一個project 是從葡萄球菌裡面提取大量核酸酶，然後研究enzyme/inhibitor interaction。這個純化可是很麻煩的事情，用gel filtration, ionexchange,hydrophobic interaction, 效率都很低。有人可能會問，怎麼不在E.Coli 表達his-tag 重組蛋白，然後用 Ni- beads 純化啊？答案很簡單，那個時候根本沒有molecular cloning 這些技術，也沒Ni-beads 這些東西，Nieads 也是親合層析的一種，是好多年以後才發明的。這個學生有一天突發奇想，既然inhibitor 可以與enzyme 結合，為什麼不能把inhibitor 固定在beads上面，然後用來純化蛋白呢？後來他試了一把，結果非常成功。搞笑的是，anfinsen 自己很懷疑這個技術是否能work, 勉強答應把自己名字署在在那個學生的文章，還強調如果沒有別人能重複，自己心就是懸著的。呵呵。從此以後，各種各樣的親合層析層出不窮，成為生物實驗室蛋白質純化的最主要工具。
八卦完歷史，現在介紹一下親合層析的種類。通用的親合層析包括IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)和IAC(Immunological Affinity Chromatography)。這些東東大家應該都熟，類似於Ni beads, protein A beads 之類的東西， 幾乎所有人都會用到。需要動點腦筋的是一些利用特定蛋白質特定性質的親合層析。比如我們實驗室研究的糖基轉移酶吧，有兩個反應底物，一個是nucleotide-sugar,另一個是一個小蛋白質 EGF repeats。 由於這個酶與兩個底物都有結合， 所以可以把這兩種底物分別結合在beads 上，然後跑兩次親合層析。AP-1 的純化呢，則是利用了轉錄因子與DNA 序列的特異結合。所以呢，在做親合層析之前，一定要根據蛋白質本身的特點來選擇相應的ligand。決定了ligand 之後呢，就得考慮怎麼把ligand 偶連在beads 上了。
CNBr 活化是最常用的一個方法。原理很簡單，CNBr 的碳對beads 上的羥基發起親電進攻，產生一種叫cyclic imido carbonate 的中間產物, 蛋白質或者核酸的伯胺基團(primary amine , -NH2) 與其發生反應， 形成共價鍵聯在beads 上。 蛋白質的primary amine 主要來自於 lysine, 如果要偶連的蛋白沒有lysine 用這種偶連方法就不好。DNA 的primary amine來自於AGC 三種鹼基。DNA 是雙鏈互補的結構，鹼基上的primary amine 都要形成氫鍵。所以呢，要想把DNA oligo 固定好，必須得有不配對的overhang 才行。這是一個小竅門，但是給我們的一個啟示是，要做好affinity resin, 了解一些基本的偶連方法的化學原理是很有用的。
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（十三）裝柱子的學問
上篇提到了Gel filtration 的基本原理，現在談談我裝柱子的過程。我們用的是Amersham的 XK26/40 的空柱子，然後往裡面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理說，要提高分辨率，柱子應該是越長越細才好，這種柱子雖然不短，但是挺粗的。但是一個好處就是，樣品體積可以大一些。
裝柱子本身就是一件很tricky 的事情，以致於這課的教程上專門列了一小節來解釋怎麼裝柱子。我們這一組人中，我負責裝柱子。一開始就是洗resin 了，用粗制燒結玻板過濾的漏斗來洗，感覺這方法還挺快的。洗完了，就把resin 重懸成50%的slurry，然後就是往柱子裡頭倒了。但是呢，有一個小竅門，就是必須先封閉柱子的下出口，往柱子裡面倒10%體積的buffer。我過去裝柱子犯傻，不知道要這麼做，結果發現下面的resin 不均勻不說，還有一大堆氣泡。所以先加buffer 是很必要的。倒slurry 的時候還得用玻棒引流，這樣可以儘可能的避免氣泡。然後就是等了，等resin 沉降３０分鐘後，就可以打開柱子的下出液口，讓多餘的緩衝液流出去。液面低到靠近柱面的時候呢，就可以把上端液流接頭接到柱子上方。
這個過程最麻煩了，主要是不能引入氣泡，所以先得讓這個接頭裝置裡面充滿緩衝液，把氣泡趕出來。我第一次做沒經驗，費了九牛二虎之力才搞定了。然後就是接上蠕動泵(peristaltic pump) 加壓，讓resin 繼續緊縮一下。隨著柱面的下降，接頭裝置還得不斷往下移動，使得接頭剛剛好與柱面接觸。接觸不緊密的話，等於是衝淡了樣品，分辨率會降低。
柱子裝好了，但還不能開始跑樣品。為什麼呢？因為這種柱子的質量必須很好才能達到分離蛋白的效果，否則是根本沒法work 的。所以呢，首先得測試這個柱子是否真的裝好了。測試過程很簡單，就是跑一下藍色葡聚糖(blue dextran)，藍色葡聚糖是帶有藍色染料的多糖高分子聚合體，體積非常大，所以在空體積(void volume)就會洗脫出來。跑藍色葡聚糖可以達到三個目的。第一個就是確定void volume，知道這個空體積是很重要的。因為每次裝柱子，實際resin 的總體積都會有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脫體積與空體積的比值是一定的，所以只要知道了空體積，就能知道蛋白大概會在什麼時候洗脫出來。第二個就是確定樣品會被稀釋多少。第三個呢，是柱子是否裝的均勻。如果裝的不均勻，葡聚糖就會跑得形狀怪異。一般來說呢，柱子下端堆積會比上端均勻，為了分辨度好，應該從更均勻的一端上樣。所以我們在做的時候，是從下端上樣的。忙活了半天，當所有裝置都裝好的時候，感覺還是挺興奮的。首先是蠕動泵，然後是柱子，然後是UV monitor 加記錄儀。整套裝置不貴，功能卻很齊全。
（十四）anfinsen的疑慮
跑完sephacryl 柱子，組分就可以過DNA affinity column。DNA affinity column 雖然很重要，但是這一步技術上來說要求很低。買來CNBR 活化好的agarose，然後讓特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最簡單便宜的一次性柱子。親合層析是目前最常用也最強大的一種蛋白質純化技術, 純化效率比別的層析方法可以高出一兩個數量級。這種方法誕生是六十年代的事情。當時是在NIH 的Anfinsen 實驗室。
Anfinsen 是一個諾貝爾獎獲得者，可以說是蛋白質折疊研究的老祖宗。他主要貢獻是通過研究ribonuclease 的變性和重折疊證明氨基酸序列就可以決定蛋白質最後的三維結構。他實驗室那時侯有一個學生一個project 是從葡萄球菌裡面提取大量核酸酶，然後研究enzyme/inhibitor interaction。這個純化可是很麻煩的事情，用gel filtration, ionexchange,hydrophobic interaction, 效率都很低。有人可能會問，怎麼不在E.Coli 表達his-tag 重組蛋白，然後用 Ni- beads 純化啊？答案很簡單，那個時候根本沒有molecular cloning 這些技術，也沒Ni-beads 這些東西，Nieads 也是親合層析的一種，是好多年以後才發明的。這個學生有一天突發奇想，既然inhibitor 可以與enzyme 結合，為什麼不能把inhibitor 固定在beads上面，然後用來純化蛋白呢？後來他試了一把，結果非常成功。搞笑的是，anfinsen 自己很懷疑這個技術是否能work, 勉強答應把自己名字署在在那個學生的文章，還強調如果沒有別人能重複，自己心就是懸著的。呵呵。從此以後，各種各樣的親合層析層出不窮，成為生物實驗室蛋白質純化的最主要工具。
八卦完歷史，現在介紹一下親合層析的種類。通用的親合層析包括IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)和IAC(Immunological Affinity Chromatography)。這些東東大家應該都熟，類似於Ni beads, protein A beads 之類的東西， 幾乎所有人都會用到。需要動點腦筋的是一些利用特定蛋白質特定性質的親合層析。比如我們實驗室研究的糖基轉移酶吧，有兩個反應底物，一個是nucleotide-sugar,另一個是一個小蛋白質 EGF repeats。 由於這個酶與兩個底物都有結合， 所以可以把這兩種底物分別結合在beads 上，然後跑兩次親合層析。AP-1 的純化呢，則是利用了轉錄因子與DNA 序列的特異結合。所以呢，在做親合層析之前，一定要根據蛋白質本身的特點來選擇相應的ligand。決定了ligand 之後呢，就得考慮怎麼把ligand 偶連在beads 上了。
CNBr 活化是最常用的一個方法。原理很簡單，CNBr 的碳對beads 上的羥基發起親電進攻，產生一種叫cyclic imido carbonate 的中間產物, 蛋白質或者核酸的伯胺基團(primary amine , -NH2) 與其發生反應， 形成共價鍵聯在beads 上。 蛋白質的primary amine 主要來自於 lysine, 如果要偶連的蛋白沒有lysine 用這種偶連方法就不好。DNA 的primary amine來自於AGC 三種鹼基。DNA 是雙鏈互補的結構，鹼基上的primary amine 都要形成氫鍵。所以呢，要想把DNA oligo 固定好，必須得有不配對的overhang 才行。這是一個小竅門，但是給我們的一個啟示是，要做好affinity resin, 了解一些基本的偶連方法的化學原理是很有用的。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-6
作者已不可考，如有人知道請告知
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（十一）核抽提物
上回談到純化AP-1 轉錄因子的大致流程。其實在過柱子之前的核抽提物的準備也是十分關鍵的。從天然產物中純化蛋白，如果大概知道蛋白在什麼細胞器官，把細胞器先分離出來作為純化的起始原料，可以省好多事情。因為細胞器官的分離的方法已經很成熟了。核抽提物是怎麼準備的呢？首先，融解Hela 細胞。我們在這個模塊用的細胞都不是自己長的，而是直接從一個公司Biovest 買來的。據說這個公司有NIH 的補貼，所以價錢不貴。一升media 的Hela 細胞才要１７刀。凍存在-80 度的hela 泡在有glycerol 的buffer 裡面，第一件事情就是要用有鎂離子的PBS 來沖洗幾遍。然後用一種低滲buffer 來重懸細胞。這種低滲buffer 鹽濃度很低，所以由於滲透壓的影響，hela 細胞膜會變得比較脆弱。這個時候呢，把重懸的細胞用Dounce 勻漿器處理一下,把細胞膜弄破。低滲buffer 裡頭雖然鹽濃度很低，但也不是沒有鹽在裡面。主要有兩種成分，一個是10mM KCl ,另一個是 1.5mM MgCl2。KCl 沒有什麼好說的，可以換成NaCl。MgCl2 就關鍵多了。鎂離子可以穩定細胞核, 讓細胞核不至於在破碎細胞的時候就破裂。當然說是這麼說，一些轉錄因子還是可能在勻漿的過程就漏出來。細胞膜破碎之後，細胞核還是基本完整的，細胞質裡面ER, Golgi 之類的東東都漏出來了。然後再來一個低速離心。細胞核是比較重的，所以一離心，馬上就沉澱下來了。而其他細胞質或者細胞膜的成分比較輕一些，還留在上清裡面。現在想起來，細胞器官的分離，幾乎無一例外都是利用細胞器比重不一樣來分離的。細胞核是最好分離的了，因為比其他的膜結構重得多。有些細胞器，比如要把Golgi 和ER 分開，是個十分麻煩的事情，因為比重相差太小了。有些時候，可以用一些古怪的辦法來分離。比如lysosome 吧，比重和粒線體及過氧化酶體很相近。一種辦法就是往一堆無辜的老鼠注射一種特殊的去垢劑叫Triton WR1339。耗子根本不能分解吸收這種化合物，就積累在肝臟細胞的lysosome 裡面，使lysosome 比重變輕了一些，這樣就可以把lysosome 從mitonchondria 和peroxysome 分出來了。話扯遠了，現在再回到AP-1purification。
細胞核雖然被沉澱下來了，但裡面還有很多染色質,如果DNA 都降解漏出來，麻煩就大了。所以下一步就是用高鹽buffer(0.42M KCl)來破碎細胞核。核膜，染色質之類的垃圾不能溶解，轉錄因子之類的蛋白卻能溶解。再一離心，取上清就行了。我們要的轉錄因子就在這裡面。按理說，到這一步就可以上柱子了，但是這種上清溶液裡面還有不少histone H1，可以抑制體外轉錄反應。為了去除Hisone, 我們又做了一步硫酸氨沉澱，histone 由於太小，沉澱不下來，而轉錄因子什麼的都可以被沉澱下來。沉澱重懸一下就可以跑Sephacryl S-300 的柱子了。
（十二）Gel filtration的先天缺陷
上一篇講到核提取物。實驗的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。
這一步實驗是整個課程中第一次跑凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography)，我感覺還是
很激動的。Gel filtration 是色譜中極其重要的一個種類。我先來談談原理吧。Gel filtration
柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。這些微珠呢，並不是實心的，而是有很多孔狀結構。
當蛋白質樣品經過這些微珠的時候，如果蛋白質分子體積太大，不能通過微珠的孔狀結構，就會繞過微珠，很快的被洗脫下來。如果蛋白質分子體積不是那麼大，可以通過微珠的孔狀結構，就會遲一些被洗脫下來。這樣，蛋白質分子可以根據大小而被gel filtration column 分開。
Gel filtration 和其他色譜方法一個顯著的不同是：Gel filtration 並不依賴蛋白質分子與柱材料的結合來分離蛋白。這個特點的一個好處是，所有的蛋白樣品最後都能被洗脫下來，柱子重複用也不會有什麼問題。但是這個特點也給Gel filtration 帶來了一個嚴重的缺陷：低分辨率。分辨率包括兩個因素，一個是兩個蛋白峰的距離，另一個是，蛋白峰的寬度。由於蛋白在gel filtration column 裡面並不與柱材料相互結合，所以很容易擴散(diffusion)，擴散的結果就是蛋白峰非常寬。這個寬度非常要命，很多時候即使用了很好的柱子，蛋白頂峰也大致能分開, 但是由於蛋白峰太寬，重疊在一起，這樣就很難分乾淨。另外，兩個不同大小蛋白的洗脫體積的差別與分子量差別的對數呈線性關系，所以可以想見，如果分子量相近（比如只差兩三倍）的話，洗脫位置也會相近，Gel filtration 是很難把兩個蛋白完全分開的。
說一件我的糗事。有一次一個師妹遇到了一個難題，表達一個GST-tagged 的蛋白有一個降解產物。她想要的蛋白50kD,而那個降解的產物有30KD。她問我該怎麼分開。我沒仔細想，就告訴她用Gel filtration。現在想起來，這實在是個昏招。當然，欣慰的是，該師妹最終沒有試gel filtration, 用別的方法解決了這個問題。:-)
如果要想蛋白峰寬度變窄一點，怎麼辦呢？就樣品而言，體積越小越好，理想狀況是小於柱體積的２％。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，這樣空體積就會小一些，擴散就不會那麼嚴重。另外柱子裡的微珠大小均勻一些也會有幫助。這種改進帶來的一個問題就是，需要用FPLC 之類的設備提供較高的壓力, 柱子才跑得動。另外分辨率好的柱子往往不能手工裝，得買預裝的柱子，這樣就很貴（很貴很貴！！！）。
嘮叨了一大堆，我想表達的一個中心意思就是：如果你想從一個蛋白質混合物很乾淨的把一個蛋白純化出來，Gel filtration 是肯定沒戲的。雖然gel filtration 不能很精細的純化蛋白，但是它還有另兩個非常重要的用途。一個是脫鹽，另一個是確定蛋白大小。這兩個用途
是其他種類的色譜沒法作到的。
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（十一）核抽提物
上回談到純化AP-1 轉錄因子的大致流程。其實在過柱子之前的核抽提物的準備也是十分關鍵的。從天然產物中純化蛋白，如果大概知道蛋白在什麼細胞器官，把細胞器先分離出來作為純化的起始原料，可以省好多事情。因為細胞器官的分離的方法已經很成熟了。核抽提物是怎麼準備的呢？首先，融解Hela 細胞。我們在這個模塊用的細胞都不是自己長的，而是直接從一個公司Biovest 買來的。據說這個公司有NIH 的補貼，所以價錢不貴。一升media 的Hela 細胞才要１７刀。凍存在-80 度的hela 泡在有glycerol 的buffer 裡面，第一件事情就是要用有鎂離子的PBS 來沖洗幾遍。然後用一種低滲buffer 來重懸細胞。這種低滲buffer 鹽濃度很低，所以由於滲透壓的影響，hela 細胞膜會變得比較脆弱。這個時候呢，把重懸的細胞用Dounce 勻漿器處理一下,把細胞膜弄破。低滲buffer 裡頭雖然鹽濃度很低，但也不是沒有鹽在裡面。主要有兩種成分，一個是10mM KCl ,另一個是 1.5mM MgCl2。KCl 沒有什麼好說的，可以換成NaCl。MgCl2 就關鍵多了。鎂離子可以穩定細胞核, 讓細胞核不至於在破碎細胞的時候就破裂。當然說是這麼說，一些轉錄因子還是可能在勻漿的過程就漏出來。細胞膜破碎之後，細胞核還是基本完整的，細胞質裡面ER, Golgi 之類的東東都漏出來了。然後再來一個低速離心。細胞核是比較重的，所以一離心，馬上就沉澱下來了。而其他細胞質或者細胞膜的成分比較輕一些，還留在上清裡面。現在想起來，細胞器官的分離，幾乎無一例外都是利用細胞器比重不一樣來分離的。細胞核是最好分離的了，因為比其他的膜結構重得多。有些細胞器，比如要把Golgi 和ER 分開，是個十分麻煩的事情，因為比重相差太小了。有些時候，可以用一些古怪的辦法來分離。比如lysosome 吧，比重和粒線體及過氧化酶體很相近。一種辦法就是往一堆無辜的老鼠注射一種特殊的去垢劑叫Triton WR1339。耗子根本不能分解吸收這種化合物，就積累在肝臟細胞的lysosome 裡面，使lysosome 比重變輕了一些，這樣就可以把lysosome 從mitonchondria 和peroxysome 分出來了。話扯遠了，現在再回到AP-1purification。
細胞核雖然被沉澱下來了，但裡面還有很多染色質,如果DNA 都降解漏出來，麻煩就大了。所以下一步就是用高鹽buffer(0.42M KCl)來破碎細胞核。核膜，染色質之類的垃圾不能溶解，轉錄因子之類的蛋白卻能溶解。再一離心，取上清就行了。我們要的轉錄因子就在這裡面。按理說，到這一步就可以上柱子了，但是這種上清溶液裡面還有不少histone H1，可以抑制體外轉錄反應。為了去除Hisone, 我們又做了一步硫酸氨沉澱，histone 由於太小，沉澱不下來，而轉錄因子什麼的都可以被沉澱下來。沉澱重懸一下就可以跑Sephacryl S-300 的柱子了。
（十二）Gel filtration的先天缺陷
上一篇講到核提取物。實驗的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。
這一步實驗是整個課程中第一次跑凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography)，我感覺還是
很激動的。Gel filtration 是色譜中極其重要的一個種類。我先來談談原理吧。Gel filtration
柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。這些微珠呢，並不是實心的，而是有很多孔狀結構。
當蛋白質樣品經過這些微珠的時候，如果蛋白質分子體積太大，不能通過微珠的孔狀結構，就會繞過微珠，很快的被洗脫下來。如果蛋白質分子體積不是那麼大，可以通過微珠的孔狀結構，就會遲一些被洗脫下來。這樣，蛋白質分子可以根據大小而被gel filtration column 分開。
Gel filtration 和其他色譜方法一個顯著的不同是：Gel filtration 並不依賴蛋白質分子與柱材料的結合來分離蛋白。這個特點的一個好處是，所有的蛋白樣品最後都能被洗脫下來，柱子重複用也不會有什麼問題。但是這個特點也給Gel filtration 帶來了一個嚴重的缺陷：低分辨率。分辨率包括兩個因素，一個是兩個蛋白峰的距離，另一個是，蛋白峰的寬度。由於蛋白在gel filtration column 裡面並不與柱材料相互結合，所以很容易擴散(diffusion)，擴散的結果就是蛋白峰非常寬。這個寬度非常要命，很多時候即使用了很好的柱子，蛋白頂峰也大致能分開, 但是由於蛋白峰太寬，重疊在一起，這樣就很難分乾淨。另外，兩個不同大小蛋白的洗脫體積的差別與分子量差別的對數呈線性關系，所以可以想見，如果分子量相近（比如只差兩三倍）的話，洗脫位置也會相近，Gel filtration 是很難把兩個蛋白完全分開的。
說一件我的糗事。有一次一個師妹遇到了一個難題，表達一個GST-tagged 的蛋白有一個降解產物。她想要的蛋白50kD,而那個降解的產物有30KD。她問我該怎麼分開。我沒仔細想，就告訴她用Gel filtration。現在想起來，這實在是個昏招。當然，欣慰的是，該師妹最終沒有試gel filtration, 用別的方法解決了這個問題。:-)
如果要想蛋白峰寬度變窄一點，怎麼辦呢？就樣品而言，體積越小越好，理想狀況是小於柱體積的２％。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，這樣空體積就會小一些，擴散就不會那麼嚴重。另外柱子裡的微珠大小均勻一些也會有幫助。這種改進帶來的一個問題就是，需要用FPLC 之類的設備提供較高的壓力, 柱子才跑得動。另外分辨率好的柱子往往不能手工裝，得買預裝的柱子，這樣就很貴（很貴很貴！！！）。
嘮叨了一大堆，我想表達的一個中心意思就是：如果你想從一個蛋白質混合物很乾淨的把一個蛋白純化出來，Gel filtration 是肯定沒戲的。雖然gel filtration 不能很精細的純化蛋白，但是它還有另兩個非常重要的用途。一個是脫鹽，另一個是確定蛋白大小。這兩個用途
是其他種類的色譜沒法作到的。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-5
作者已不可考，如有人知道請告知
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（九） 沉澱，沉澱，沉澱
上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉澱來去掉PEI (Polyethyleneimine）的步驟。不常做生化的同學可能對硫酸氨沉澱的方法不熟悉。但其實這種沉澱是蛋白質純化中及其重要的一種方法。說實話我過去也很少接觸，但是在這個課裡面，四組實驗中有三個都用到了這個方法，可見其重要性。硫酸氨沉澱是怎麼做的呢?其實很簡單，把磨細了的硫酸氨粉末往樣品溶液裡倒就行了，蛋白就會相繼沉澱下來。由於不同的蛋白，在不同的硫酸氨濃度下被分別沉澱下來，這種方法把蛋白質樣品粗粗的分離一下。這種方法對大量樣品尤其好用，因為比較方便快捷便宜。硫酸氨沉澱的優點是什麼呢？最大的優點是這東西雖然能讓蛋白質沉澱下來，但是不會讓蛋白質變性，所以沉澱下來的蛋白質一般可以重新溶解。其實沉澱蛋白質的方法有很多種，但是對於嬌貴的蛋白質來說，很多常用方法都太harsh 了。
我舉兩個例子把：TCA沉澱大家都熟悉的。TCA 是個強酸，施放出來的質子中和了蛋白質的負電荷，只留下正電荷與TCA 形成不溶物，從而變性。丙酮沉澱，通過改變介電常數來降低蛋白質的溶解度，從而沉澱，由於丙酮一類的有機溶劑可以與蛋白質的疏水表面相互作用，所以沉澱的同時，蛋白質也會變性。硫酸氨沉澱的機理是什麼呢？簡而言之就是鹽析（salt out）。蛋白質在溶液裡面溶解度和鹽濃度有關系。在低鹽濃度下，如果增加鹽濃度，會增強蛋白質的溶解，這是因為，鹽的離子與蛋白質表面的正負電荷配對，減少了蛋白質電荷表面相互作用的機會。
當鹽濃度高到一定程度的時候，過多的鹽會跟蛋白質疏水表面爭奪水分子， 以至於蛋白質疏水表面傾向於相互作用形成聚合物沉澱下來。
硫酸氨如果運用的好可以幫很大的忙。Dr. Burgess 講過一個例子。他有一年去一個公司做sabbatical。這個公司是做單抗的，有一個工序是要從ascites fluids 裡頭把抗體給純化出來。這個公司用硫酸氨沉澱的方法來粗分蛋白。Burgess 很驚訝的發現，這個公司竟然沒有做仔細的分析，就隨便用了一個很高的硫酸氨濃度，結果把抗體和serum albumin 一起沉澱了。但是其實可以用一個低一點的濃度，只把serum albumin 沉澱下來，從而把抗體和serum albumin 分開。Serum albumin 濃度是非常高的了，這樣一分，大大提高了後續純化步驟的效率。
Dr. Burgess 強調說，用什麼濃度把什麼蛋白沉澱下來，完全是經驗性的，而且每次都不一定能重複的。因為是否能沉澱下來跟蛋白質濃度有關係，而每次樣品內目標蛋白的濃度不一定一樣。有一個很簡單的方法可以用來估計蛋白質沉澱所需 酸氨的濃度。把樣品分成五份，每份分別加硫酸氨至20%, 30%, 40%, 50%, 60%，離心去掉沉澱，保留上清，再向上清裡面添加硫酸氨使濃度從20%到30%, 30%到40%, 40%到50%, 50%到60%, 60%到70%，離心保留沉澱，然後分析沉澱裡的蛋白，看看目標蛋白到底在哪裡，就完事了。
（十） 永遠的轉錄因子
第一個模塊的實驗結束以後，我們進入第二個模塊的實驗。這個實驗的指導教授叫AlCourey。這個模塊的實驗主要是要從Hela 細胞裡純化AP-1。AP1 是一種很重要的sequence specific 轉錄因子，在很多生理過程裡都有作用。AP-1 其實不是一種均一的蛋白質，實際上一種二聚體結構，要麼是Jun-Jun 或者是JunFos dimer。Jun 和Fos 都是alpha helix 的結構。Helix 的一邊有很多Leu,和另一個helix 形成Leucine Zipper 的結構，而helix 另一邊就是鹼性的氨基酸居多，所以可以和DNA 結合。這個轉錄因子看起來就像一雙筷子夾著DNA。sequence specific 轉錄因子是極其重要的一類蛋白質，真核生物的基因有5~10%是用來編碼這種蛋白的。這個模塊涉及的一些實驗是最經典的一些分離轉錄因子的方法，所以很有用。怎麼才能分離純化呢？首先要確定要純化什麼因子，換句話說就是要決定純化跟什麼特異DNA 序列相結合的轉錄因子。決定了這個，才能有一個活性檢測系統，才能真正開始純化。另外就是，可以把這種特異序列的DNA 固定在柱子上，然後做親合層析，純化效率會非常高。
整個純化過程是這樣的：首先製備Hela 細胞的核提取物，然後用硫酸氨沉澱的辦法粗分一下組分，小分子量蛋白(比如Histone H1) 因為無法沉澱而被去掉。到這裡比活力會增加到原來的2 倍。然後粗分的產物再跑一下凝膠過濾層析，比活力再提高到初始產物的5 到10 倍。凝膠過濾的產物再過DNA affinity column, 比活力從5-10 倍一下子提到了50~100 倍。到了這一步，AP-1 可以占到蛋白量的 10~50%。值得一提的是這個凝膠過濾層析。我們用的是Sephacryl S-300 HR 凝膠(一種聚丙烯酰胺凝膠)，這種凝膠分辨範圍大概是10KDa 到幾千KDa，但是這種凝膠是比較粗的一種介質，分辨率不能跟superdex 之類的比。大概由於不是那麼精細，所以可以自己手工裝柱，我們用的柱子是Amersham 的XK26/40(直徑2.6cm, 高度40cm）。裝好的柱子分辨率真的是很
低，AP1 的洗脫體積跟空體積(void volume）相差挺小，而AP-1 只有40~50KD 已經很小了。這樣一來很多蛋白根本沒可能和AP-1 分開！這也就是為什麼這一步純化倍數很小的原因。這樣一來，為什麼要自找麻煩做這又貴又麻煩的一步呢？原因在於這一步可以去掉核提取物裡面的核酸酶，所以如果直接跑DNA affinity column, column 上的DNA Oligos 會被降解掉！另外一個原因是，核提取物有一些可以和DNA 非特異結合的蛋白，這些蛋白會飽和DNA affinity column，影響要轉錄因子的純化。
這個純化步驟說明，不同的純化手段必須加以精心組合才會有最好的效果。
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（九） 沉澱，沉澱，沉澱
上一部分我匆匆提到了用硫酸氨沉澱來去掉PEI (Polyethyleneimine）的步驟。不常做生化的同學可能對硫酸氨沉澱的方法不熟悉。但其實這種沉澱是蛋白質純化中及其重要的一種方法。說實話我過去也很少接觸，但是在這個課裡面，四組實驗中有三個都用到了這個方法，可見其重要性。硫酸氨沉澱是怎麼做的呢?其實很簡單，把磨細了的硫酸氨粉末往樣品溶液裡倒就行了，蛋白就會相繼沉澱下來。由於不同的蛋白，在不同的硫酸氨濃度下被分別沉澱下來，這種方法把蛋白質樣品粗粗的分離一下。這種方法對大量樣品尤其好用，因為比較方便快捷便宜。硫酸氨沉澱的優點是什麼呢？最大的優點是這東西雖然能讓蛋白質沉澱下來，但是不會讓蛋白質變性，所以沉澱下來的蛋白質一般可以重新溶解。其實沉澱蛋白質的方法有很多種，但是對於嬌貴的蛋白質來說，很多常用方法都太harsh 了。
我舉兩個例子把：TCA沉澱大家都熟悉的。TCA 是個強酸，施放出來的質子中和了蛋白質的負電荷，只留下正電荷與TCA 形成不溶物，從而變性。丙酮沉澱，通過改變介電常數來降低蛋白質的溶解度，從而沉澱，由於丙酮一類的有機溶劑可以與蛋白質的疏水表面相互作用，所以沉澱的同時，蛋白質也會變性。硫酸氨沉澱的機理是什麼呢？簡而言之就是鹽析（salt out）。蛋白質在溶液裡面溶解度和鹽濃度有關系。在低鹽濃度下，如果增加鹽濃度，會增強蛋白質的溶解，這是因為，鹽的離子與蛋白質表面的正負電荷配對，減少了蛋白質電荷表面相互作用的機會。
當鹽濃度高到一定程度的時候，過多的鹽會跟蛋白質疏水表面爭奪水分子， 以至於蛋白質疏水表面傾向於相互作用形成聚合物沉澱下來。
硫酸氨如果運用的好可以幫很大的忙。Dr. Burgess 講過一個例子。他有一年去一個公司做sabbatical。這個公司是做單抗的，有一個工序是要從ascites fluids 裡頭把抗體給純化出來。這個公司用硫酸氨沉澱的方法來粗分蛋白。Burgess 很驚訝的發現，這個公司竟然沒有做仔細的分析，就隨便用了一個很高的硫酸氨濃度，結果把抗體和serum albumin 一起沉澱了。但是其實可以用一個低一點的濃度，只把serum albumin 沉澱下來，從而把抗體和serum albumin 分開。Serum albumin 濃度是非常高的了，這樣一分，大大提高了後續純化步驟的效率。
Dr. Burgess 強調說，用什麼濃度把什麼蛋白沉澱下來，完全是經驗性的，而且每次都不一定能重複的。因為是否能沉澱下來跟蛋白質濃度有關係，而每次樣品內目標蛋白的濃度不一定一樣。有一個很簡單的方法可以用來估計蛋白質沉澱所需 酸氨的濃度。把樣品分成五份，每份分別加硫酸氨至20%, 30%, 40%, 50%, 60%，離心去掉沉澱，保留上清，再向上清裡面添加硫酸氨使濃度從20%到30%, 30%到40%, 40%到50%, 50%到60%, 60%到70%，離心保留沉澱，然後分析沉澱裡的蛋白，看看目標蛋白到底在哪裡，就完事了。
（十） 永遠的轉錄因子
第一個模塊的實驗結束以後，我們進入第二個模塊的實驗。這個實驗的指導教授叫AlCourey。這個模塊的實驗主要是要從Hela 細胞裡純化AP-1。AP1 是一種很重要的sequence specific 轉錄因子，在很多生理過程裡都有作用。AP-1 其實不是一種均一的蛋白質，實際上一種二聚體結構，要麼是Jun-Jun 或者是JunFos dimer。Jun 和Fos 都是alpha helix 的結構。Helix 的一邊有很多Leu,和另一個helix 形成Leucine Zipper 的結構，而helix 另一邊就是鹼性的氨基酸居多，所以可以和DNA 結合。這個轉錄因子看起來就像一雙筷子夾著DNA。sequence specific 轉錄因子是極其重要的一類蛋白質，真核生物的基因有5~10%是用來編碼這種蛋白的。這個模塊涉及的一些實驗是最經典的一些分離轉錄因子的方法，所以很有用。怎麼才能分離純化呢？首先要確定要純化什麼因子，換句話說就是要決定純化跟什麼特異DNA 序列相結合的轉錄因子。決定了這個，才能有一個活性檢測系統，才能真正開始純化。另外就是，可以把這種特異序列的DNA 固定在柱子上，然後做親合層析，純化效率會非常高。
整個純化過程是這樣的：首先製備Hela 細胞的核提取物，然後用硫酸氨沉澱的辦法粗分一下組分，小分子量蛋白(比如Histone H1) 因為無法沉澱而被去掉。到這裡比活力會增加到原來的2 倍。然後粗分的產物再跑一下凝膠過濾層析，比活力再提高到初始產物的5 到10 倍。凝膠過濾的產物再過DNA affinity column, 比活力從5-10 倍一下子提到了50~100 倍。到了這一步，AP-1 可以占到蛋白量的 10~50%。值得一提的是這個凝膠過濾層析。我們用的是Sephacryl S-300 HR 凝膠(一種聚丙烯酰胺凝膠)，這種凝膠分辨範圍大概是10KDa 到幾千KDa，但是這種凝膠是比較粗的一種介質，分辨率不能跟superdex 之類的比。大概由於不是那麼精細，所以可以自己手工裝柱，我們用的柱子是Amersham 的XK26/40(直徑2.6cm, 高度40cm）。裝好的柱子分辨率真的是很
低，AP1 的洗脫體積跟空體積(void volume）相差挺小，而AP-1 只有40~50KD 已經很小了。這樣一來很多蛋白根本沒可能和AP-1 分開！這也就是為什麼這一步純化倍數很小的原因。這樣一來，為什麼要自找麻煩做這又貴又麻煩的一步呢？原因在於這一步可以去掉核提取物裡面的核酸酶，所以如果直接跑DNA affinity column, column 上的DNA Oligos 會被降解掉！另外一個原因是，核提取物有一些可以和DNA 非特異結合的蛋白，這些蛋白會飽和DNA affinity column，影響要轉錄因子的純化。
這個純化步驟說明，不同的純化手段必須加以精心組合才會有最好的效果。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-4
作者已不可考，如有人知道請告知
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（七）古怪的CDC6
這裡再給大家講一個在大腸桿菌中表達蛋白質的例子，一個很誇張的例子，但是很有啟發性。Bruce Stillman 是冷泉港的現任主管，是一個絕對的牛人。不但科學做得很好，而且還很愛國。他是澳洲人，在美國待了N 年，卻從沒有加入美國國籍，所以他只是外籍院士。
我們的晚間報告有一個是他作的。他主要研究真核生物的DNA 複製。這是一個到現在為止都沒有完全弄明白的領域。在報告裡面，他特別提到了表達純化CDC6 蛋白的經歷，我覺得十分有意思。這個蛋白, 用他的話說，是"a pain in the ass"。
CDC6 是幹什麼的呢？這要從ORC 說起。真核生物的DNA 有多個複製起始位點(replication origin)，ORC(Origin Replication Complex)是一個很大的蛋白複合體，可以識別這些複製起始位點。ORC 在整個細胞週期裡面都是與DNA 結合的。在G1 期裡面，CDC6 這個蛋白會與ORC 結合，同時讓MCM(DNA 解旋酶)也裝載到ORC 上，形成一個pre-replicationprotein complex。這個complex 一旦形成，DNA 複製的準備工作就完成，只等其他kinase的激活，細胞從G1 進入S 期，複製就開始。
Stillman 實驗室一直想表達酵母的CDC6 和ORC 的重組蛋白，然後做結構研究。但是到了CDC6，他們碰到了大麻煩。首先他們嘗試真核系統來表達，但是意外的是，他們發現表達出來的CDC6 完全沒有活性。然後他們嘗試用大腸桿菌來表達。首先發現37 度誘導表達出來的蛋白不溶，重折疊也沒有用。然後他們嘗試在室溫下誘導表達，發現蛋白雖然可溶了，但是都被降解了。然後呢，他們就想到了加一個GSTtag ,這下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是還是沒有活性。他們估計是因為GST 可以形成dimer，干擾CDC6 的正常功能。所以呢，他們重新做了一個Construct,在GST 和CDC6 序列中間加了一個蛋白酶切割位點。正當他們滿心歡喜的以為問題解決了的時候，意外又出現了。有GST 的CDC6 是可溶的，可是一旦把GST 切掉了，CDC 就沉澱出來了....#%#^&%$^#!!!
幾乎是山窮水盡了，但是做這個project 的博士後還是沒有放棄希望，他做了最後的孤注一擲。他猜到這個蛋白可能很不穩定，對緩衝液要求可能很高，所以他讓一個本科生連續試了十多種buffer，最後發現如果用磷酸鉀＋谷氨酸鉀緩衝液，切掉GST 之後CDC6 就不會沉澱了。Stillman 認為谷氨酸根和磷酸根跟氯離子相比更接近核酸，可能讓CDC6 更穩定。這個CDC6 一共花了他們18 個月時間, 卻就這一點小trick! 這以後，他們表達的CDC6 都有活性了，後來做了一系列的電鏡三維結構重構實驗，研究CDC6 和ORC 的復合體結構。Stillman 實驗室正在準備一篇文章要投到nature上去。大家等著看吧。
（八）“液體DEAE”
繞了這麼大一圈，現在再回到第一個模塊的實驗來。前面提到Dr.Burgess 要我們試Gudn HCl 溶解sigma32 之後的重折疊，結果很糟糕。我們接著試了用sarkosyl 做變性劑的蛋白重折疊。步驟和前一個類似，只是這一次是突然稀釋至25 倍體積。效果好了很多，至少沒有渾濁現像了。接著我們用Poros HS 50，一種陽離子交換柱，來把可溶的sigma32 分離了出來。為什麼這一次用Poros HS 50 而不是前面用的陰離子交換柱呢？因為sarkosyl 帶負電，會與陰離子交換柱結合得很好。再加上sigma32 很奇怪，既有負電的表面，又有帶正電的表面，所以可以用陽離子交換柱。值得一提的是絕大部分蛋白質都是偏酸性，所以陰離子交換柱用的比陽離子交換柱頻繁得多。
好了，聊完離子交換柱，現在回到Dr Burgess 要我們作的另一個很重要的實驗。Sigma32 在大腸杆菌過表達的時候，絕大部分都是inclusion body,但是也有一部分是可溶的。這些可溶的sigma 32 可以和細菌體內的Core RNA polymerase 結合形成複合體。我們這個實驗就是要把這個複合體純化出來。核心辦法是用免疫親合柱來純化。但是為了提高純化的效果，Burgess 要我們提前用PEI 沉澱的辦法來粗分一下。
PEI 是什麼呢？就是polyethyleneimine （聚乙烯亞胺）。這個東東我過去沒碰到，所以很感興趣。PEI 呢是一個帶正電的polymer，和酸性蛋白質和核酸結合以後聚合體沉澱出來。由於這種結合是受離子強度影響的，感覺上很像DEAE 那之類的性質，所以Burgess稱之為"液體DEAE"。RNA polymerase 和DNA 是結合的，所以PEI 沉澱DNA 的同時，把RNA polymerase+sigma32 都沉澱了下來。然後再用高鹽洗脫蛋白質，而DNA 和PEI 結合很緊密，所以還是在沉澱裡面。這樣一來，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。到了這一步，還有一個問題。就是洗脫下來的蛋白裡面還有PEI, 如果現在就用透析的辦法降低鹽濃度，PEI和蛋白會重新形成沉澱。所以下一步就是用硫酸胺沉澱的辦法把蛋白和PEI 分開。用低鹽buffer 重溶沉澱的蛋白,過免疫親合柱就行了。免疫親合柱就沒有什麼好說的了。最後結果很不錯，跑膠後用coomassie blue 就可以清楚的看到RNA polymerase 的各個亞基。
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（七）古怪的CDC6
這裡再給大家講一個在大腸桿菌中表達蛋白質的例子，一個很誇張的例子，但是很有啟發性。Bruce Stillman 是冷泉港的現任主管，是一個絕對的牛人。不但科學做得很好，而且還很愛國。他是澳洲人，在美國待了N 年，卻從沒有加入美國國籍，所以他只是外籍院士。
我們的晚間報告有一個是他作的。他主要研究真核生物的DNA 複製。這是一個到現在為止都沒有完全弄明白的領域。在報告裡面，他特別提到了表達純化CDC6 蛋白的經歷，我覺得十分有意思。這個蛋白, 用他的話說，是"a pain in the ass"。
CDC6 是幹什麼的呢？這要從ORC 說起。真核生物的DNA 有多個複製起始位點(replication origin)，ORC(Origin Replication Complex)是一個很大的蛋白複合體，可以識別這些複製起始位點。ORC 在整個細胞週期裡面都是與DNA 結合的。在G1 期裡面，CDC6 這個蛋白會與ORC 結合，同時讓MCM(DNA 解旋酶)也裝載到ORC 上，形成一個pre-replicationprotein complex。這個complex 一旦形成，DNA 複製的準備工作就完成，只等其他kinase的激活，細胞從G1 進入S 期，複製就開始。
Stillman 實驗室一直想表達酵母的CDC6 和ORC 的重組蛋白，然後做結構研究。但是到了CDC6，他們碰到了大麻煩。首先他們嘗試真核系統來表達，但是意外的是，他們發現表達出來的CDC6 完全沒有活性。然後他們嘗試用大腸桿菌來表達。首先發現37 度誘導表達出來的蛋白不溶，重折疊也沒有用。然後他們嘗試在室溫下誘導表達，發現蛋白雖然可溶了，但是都被降解了。然後呢，他們就想到了加一個GSTtag ,這下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是還是沒有活性。他們估計是因為GST 可以形成dimer，干擾CDC6 的正常功能。所以呢，他們重新做了一個Construct,在GST 和CDC6 序列中間加了一個蛋白酶切割位點。正當他們滿心歡喜的以為問題解決了的時候，意外又出現了。有GST 的CDC6 是可溶的，可是一旦把GST 切掉了，CDC 就沉澱出來了....#%#^&%$^#!!!
幾乎是山窮水盡了，但是做這個project 的博士後還是沒有放棄希望，他做了最後的孤注一擲。他猜到這個蛋白可能很不穩定，對緩衝液要求可能很高，所以他讓一個本科生連續試了十多種buffer，最後發現如果用磷酸鉀＋谷氨酸鉀緩衝液，切掉GST 之後CDC6 就不會沉澱了。Stillman 認為谷氨酸根和磷酸根跟氯離子相比更接近核酸，可能讓CDC6 更穩定。這個CDC6 一共花了他們18 個月時間, 卻就這一點小trick! 這以後，他們表達的CDC6 都有活性了，後來做了一系列的電鏡三維結構重構實驗，研究CDC6 和ORC 的復合體結構。Stillman 實驗室正在準備一篇文章要投到nature上去。大家等著看吧。
（八）“液體DEAE”
繞了這麼大一圈，現在再回到第一個模塊的實驗來。前面提到Dr.Burgess 要我們試Gudn HCl 溶解sigma32 之後的重折疊，結果很糟糕。我們接著試了用sarkosyl 做變性劑的蛋白重折疊。步驟和前一個類似，只是這一次是突然稀釋至25 倍體積。效果好了很多，至少沒有渾濁現像了。接著我們用Poros HS 50，一種陽離子交換柱，來把可溶的sigma32 分離了出來。為什麼這一次用Poros HS 50 而不是前面用的陰離子交換柱呢？因為sarkosyl 帶負電，會與陰離子交換柱結合得很好。再加上sigma32 很奇怪，既有負電的表面，又有帶正電的表面，所以可以用陽離子交換柱。值得一提的是絕大部分蛋白質都是偏酸性，所以陰離子交換柱用的比陽離子交換柱頻繁得多。
好了，聊完離子交換柱，現在回到Dr Burgess 要我們作的另一個很重要的實驗。Sigma32 在大腸杆菌過表達的時候，絕大部分都是inclusion body,但是也有一部分是可溶的。這些可溶的sigma 32 可以和細菌體內的Core RNA polymerase 結合形成複合體。我們這個實驗就是要把這個複合體純化出來。核心辦法是用免疫親合柱來純化。但是為了提高純化的效果，Burgess 要我們提前用PEI 沉澱的辦法來粗分一下。
PEI 是什麼呢？就是polyethyleneimine （聚乙烯亞胺）。這個東東我過去沒碰到，所以很感興趣。PEI 呢是一個帶正電的polymer，和酸性蛋白質和核酸結合以後聚合體沉澱出來。由於這種結合是受離子強度影響的，感覺上很像DEAE 那之類的性質，所以Burgess稱之為"液體DEAE"。RNA polymerase 和DNA 是結合的，所以PEI 沉澱DNA 的同時，把RNA polymerase+sigma32 都沉澱了下來。然後再用高鹽洗脫蛋白質，而DNA 和PEI 結合很緊密，所以還是在沉澱裡面。這樣一來，好多垃圾蛋白和核酸都被去掉了。到了這一步，還有一個問題。就是洗脫下來的蛋白裡面還有PEI, 如果現在就用透析的辦法降低鹽濃度，PEI和蛋白會重新形成沉澱。所以下一步就是用硫酸胺沉澱的辦法把蛋白和PEI 分開。用低鹽buffer 重溶沉澱的蛋白,過免疫親合柱就行了。免疫親合柱就沒有什麼好說的了。最後結果很不錯，跑膠後用coomassie blue 就可以清楚的看到RNA polymerase 的各個亞基。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-3
作者已不可考，如有人知道請告知
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（五）"萬金油"buffer
Dr. Burgess 這人特有意思，喜歡吹噓他發現的小trick。比如，他得意說他是全美國最早用coomassie blue 染蛋白膠的人。據他說，六幾年的時候他看到一個澳洲的老兄的一片文章,講述一種新奇的染料叫考馬市亮藍, 比當時流行的染料amido black 靈敏十倍以上。所以他就寫了一封信要了一些，結果效果奇好。我們聽得都目瞪口呆。
不過Burgess 最自豪的，還是他的“萬金油”buffer。他告訴我們說，他幾十年了，總喜歡用這個buffer 的配方，什麼蛋白都喜歡這種buffer, 可以說到了包治百病的神奇地步。儘管他吹得神乎其神，配方卻十分簡單。這個buffer 叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是這樣的:
50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol
Tris EDTA NaCl 這三樣都沒什麼，真正關鍵的是5%glycerol。有了這個glycerol，很多蛋白，尤其是酶會十分穩定。這個穩定的效果是十分驚人的。Dr.Burgess 就此跟我們講了他的經歷。六十年代的時候，他還是個小博士後，在watson 實驗室裡幹，主要是純化細菌RNA polymerase 的各個亞基。那時候一個大問題是RNA polymerase 純化出來後十分不穩定, 放冰上, 過30分鐘，活性還會損失一半。Burgess 有一次不小心出了錯誤，把純化出來的RNA polymerase 和glycerol 混合了。結果意外發現，RNA polymerase 變得十分十分的穩定。
穩定到什麼程度呢,就是你把這個酶加上50%glycerol，用平信從美國寄十幾天到澳洲，活性還有7~80%！另外Burgess 也提到，如果要保存的蛋白有二硫鍵，加一點DTT，防止蛋白形成非天然的二硫鍵, 也會對蛋白質的穩定有好處。
為了讓我們對這個 "萬金油"buffer 的好處有感性認識，Burgess 設計了一個實驗讓我們做。
他之前已經準備好了在大腸桿菌中表達的GFP 包涵體(inclusion body)。我們把包涵體分成兩部分，一部分用guanidinium hydrochloride（鹽酸胍）溶解變性，另一部分用sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸鈉）溶解變性。然後把這些溶解的GFP 溶液分到一個96 孔板上,每個孔10微升，然後加入２０倍的refolding buffer 來稀釋，稀釋了之後，變性的GFP 就開始重折疊。我們有一個hampton 賣的refolding 試劑盒，內有十幾種不同配方的refolding solution。我們試了所有這些buffer 同時還試了TGE, TGE+15% glycerol, TGE+35% glycerol, TGE+45%glycerol,這四種buffer。由於GFP 折疊好了才能發螢光，用一個fluorescence plater reader，我們可以實時監控折疊的效果。結果讓人很吃驚，Hamton 賣的這個試劑盒，雖然配方都很fancy,但是一塌糊塗，沒有一種溶液能讓GFP 重折疊的很好。相比之下，TGE 的四種溶液都很好，GFP 重折疊的效率是hampton kit 的幾十倍。最強的是TGE+35% glycerol。另外，不論是用Gudn HC 變性還是用sarkosyl 來變性，TGE+glycerol 的重折疊的效果都很好。
實驗結果出來後，看著我們驚訝的表情，Burgess 臉上都笑開花了，呵呵。這個實驗我還學到的一個教訓是,不能迷信商業化的kit, 很多kit 吹得很牛，但並不一定真的好用。
（六）興風作浪的乳糖(lactose)
晚上每天都有人做報告，我覺得讓我收獲最大的是Bill Studier 的報告。本來這個報告是後來才聽到的， 但是由於Burgess 的模塊是惟一的涉及大腸杆菌鐘表達蛋白的，我把這一段提前來說說。Studier 這老哥是Brookhaven National Laboratory 的，一生研究T7 噬菌體，也是T7 RNA polymerase induction system(pET 系列質粒)的發明者。T7 系統在大腸杆菌表達蛋白的應用實在太廣泛了，但凡表達蛋白的兄弟姐妹們的不可能不知道這個系統。長話短說，pET 系列的質粒都用T7 promoter 來控制基因的表達。T7 promoter 只能被T7 RNA polymerase 識別，而這個咚咚大腸杆菌是沒有的。但是有一些溶原菌株,染色體裡面已經整合入了由LacUV promoter 和lac operon 控制的T7 RNA polymerase 基因片斷。如果在細菌培養基裡面加入IPTG, 來誘導T7 RNA polymerase 的表達，就可以啟動目的蛋白的表達。
這個系統非常強大，原因在於T7 RNA polymerase 工作起來非常有效率，效率高到什麼地步呢？就是表達一個蛋白，表達量可以占到大腸杆菌總蛋白量的50%! 大家可以想像，這種系統雖然很強大，但是表達量太大，對大腸桿菌有毒性，造成的結果就是大腸桿菌十分排斥表達蛋白的質粒。
這一點我深有體會。我曾經想用細菌表達一個蛋白,而且估計這個蛋白會形成包涵體。奇怪的是，用質粒轉化蛋白表達菌株BL21(DE3)怎麼也不能轉化，鋪的板一個菌落也沒有。
我當時就懷疑是因為表達的蛋白對大腸桿菌有毒性，僅僅是本底的一點表達就足以殺死細菌。我來來回回一共轉化了五六次，最後 終於找到了唯一的一個菌落。雖然當時我懷疑過本底表達是罪魁禍首，但是我沒有仔細想過本底是怎麼來的。
這個問題到了bill studier 做報告之後，才真相大白。原來我們一般用的LB broth 有三種成分，其中一種是tryptone。Tryptone 是caseine 的酶解產物，而casein 又是milk 裡提取而來。
由於milk 有乳糖(lactose)，tryptone 裡面也有乳糖的污染。Bill studier 研究發現即使很微量的lactose 也能有效的誘導蛋白表達。原來如此！！！
所以要解決我原來的那個問題，用一種不含有乳糖的media 做培養板就完事了。有意思的是，細菌有一種很有意思的特點，如果培養基裡有足量的glucose，細菌會優先攝取glucose，而不能攝取lactose。Bill studier 根據這個特點研究出一種可以自動誘導的培養基。這種培養基含有成比例的glucose 和lactose。細菌首先攝取glucose，不攝取lactose，當細菌長到一定密度，耗完glucose 之後，就開始攝取lactose，從而開始誘導表達。所以用這種培養基養菌，很省事，接種了第二天收細菌，提蛋白就行了。
最後Bill studier 老爺子特別強調的是細菌的供氧。氧氣是限制細菌生長最重要的瓶頸，如果有足夠氧氣在培養基裡面，大腸杆菌的密度可以從一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30！要提高培養瓶的供氧，可以用baffled flask。這種flask 的瓶底邊緣有幾處凹陷(類似於可樂塑料瓶底那樣的形狀)，能有效增加空氣的培養基的混合。
最後，詳細內容可以見下列文獻:
Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005)
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（五）"萬金油"buffer
Dr. Burgess 這人特有意思，喜歡吹噓他發現的小trick。比如，他得意說他是全美國最早用coomassie blue 染蛋白膠的人。據他說，六幾年的時候他看到一個澳洲的老兄的一片文章,講述一種新奇的染料叫考馬市亮藍, 比當時流行的染料amido black 靈敏十倍以上。所以他就寫了一封信要了一些，結果效果奇好。我們聽得都目瞪口呆。
不過Burgess 最自豪的，還是他的“萬金油”buffer。他告訴我們說，他幾十年了，總喜歡用這個buffer 的配方，什麼蛋白都喜歡這種buffer, 可以說到了包治百病的神奇地步。儘管他吹得神乎其神，配方卻十分簡單。這個buffer 叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是這樣的:
50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol
Tris EDTA NaCl 這三樣都沒什麼，真正關鍵的是5%glycerol。有了這個glycerol，很多蛋白，尤其是酶會十分穩定。這個穩定的效果是十分驚人的。Dr.Burgess 就此跟我們講了他的經歷。六十年代的時候，他還是個小博士後，在watson 實驗室裡幹，主要是純化細菌RNA polymerase 的各個亞基。那時候一個大問題是RNA polymerase 純化出來後十分不穩定, 放冰上, 過30分鐘，活性還會損失一半。Burgess 有一次不小心出了錯誤，把純化出來的RNA polymerase 和glycerol 混合了。結果意外發現，RNA polymerase 變得十分十分的穩定。
穩定到什麼程度呢,就是你把這個酶加上50%glycerol，用平信從美國寄十幾天到澳洲，活性還有7~80%！另外Burgess 也提到，如果要保存的蛋白有二硫鍵，加一點DTT，防止蛋白形成非天然的二硫鍵, 也會對蛋白質的穩定有好處。
為了讓我們對這個 "萬金油"buffer 的好處有感性認識，Burgess 設計了一個實驗讓我們做。
他之前已經準備好了在大腸桿菌中表達的GFP 包涵體(inclusion body)。我們把包涵體分成兩部分，一部分用guanidinium hydrochloride（鹽酸胍）溶解變性，另一部分用sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸鈉）溶解變性。然後把這些溶解的GFP 溶液分到一個96 孔板上,每個孔10微升，然後加入２０倍的refolding buffer 來稀釋，稀釋了之後，變性的GFP 就開始重折疊。我們有一個hampton 賣的refolding 試劑盒，內有十幾種不同配方的refolding solution。我們試了所有這些buffer 同時還試了TGE, TGE+15% glycerol, TGE+35% glycerol, TGE+45%glycerol,這四種buffer。由於GFP 折疊好了才能發螢光，用一個fluorescence plater reader，我們可以實時監控折疊的效果。結果讓人很吃驚，Hamton 賣的這個試劑盒，雖然配方都很fancy,但是一塌糊塗，沒有一種溶液能讓GFP 重折疊的很好。相比之下，TGE 的四種溶液都很好，GFP 重折疊的效率是hampton kit 的幾十倍。最強的是TGE+35% glycerol。另外，不論是用Gudn HC 變性還是用sarkosyl 來變性，TGE+glycerol 的重折疊的效果都很好。
實驗結果出來後，看著我們驚訝的表情，Burgess 臉上都笑開花了，呵呵。這個實驗我還學到的一個教訓是,不能迷信商業化的kit, 很多kit 吹得很牛，但並不一定真的好用。
（六）興風作浪的乳糖(lactose)
晚上每天都有人做報告，我覺得讓我收獲最大的是Bill Studier 的報告。本來這個報告是後來才聽到的， 但是由於Burgess 的模塊是惟一的涉及大腸杆菌鐘表達蛋白的，我把這一段提前來說說。Studier 這老哥是Brookhaven National Laboratory 的，一生研究T7 噬菌體，也是T7 RNA polymerase induction system(pET 系列質粒)的發明者。T7 系統在大腸杆菌表達蛋白的應用實在太廣泛了，但凡表達蛋白的兄弟姐妹們的不可能不知道這個系統。長話短說，pET 系列的質粒都用T7 promoter 來控制基因的表達。T7 promoter 只能被T7 RNA polymerase 識別，而這個咚咚大腸杆菌是沒有的。但是有一些溶原菌株,染色體裡面已經整合入了由LacUV promoter 和lac operon 控制的T7 RNA polymerase 基因片斷。如果在細菌培養基裡面加入IPTG, 來誘導T7 RNA polymerase 的表達，就可以啟動目的蛋白的表達。
這個系統非常強大，原因在於T7 RNA polymerase 工作起來非常有效率，效率高到什麼地步呢？就是表達一個蛋白，表達量可以占到大腸杆菌總蛋白量的50%! 大家可以想像，這種系統雖然很強大，但是表達量太大，對大腸桿菌有毒性，造成的結果就是大腸桿菌十分排斥表達蛋白的質粒。
這一點我深有體會。我曾經想用細菌表達一個蛋白,而且估計這個蛋白會形成包涵體。奇怪的是，用質粒轉化蛋白表達菌株BL21(DE3)怎麼也不能轉化，鋪的板一個菌落也沒有。
我當時就懷疑是因為表達的蛋白對大腸桿菌有毒性，僅僅是本底的一點表達就足以殺死細菌。我來來回回一共轉化了五六次，最後 終於找到了唯一的一個菌落。雖然當時我懷疑過本底表達是罪魁禍首，但是我沒有仔細想過本底是怎麼來的。
這個問題到了bill studier 做報告之後，才真相大白。原來我們一般用的LB broth 有三種成分，其中一種是tryptone。Tryptone 是caseine 的酶解產物，而casein 又是milk 裡提取而來。
由於milk 有乳糖(lactose)，tryptone 裡面也有乳糖的污染。Bill studier 研究發現即使很微量的lactose 也能有效的誘導蛋白表達。原來如此！！！
所以要解決我原來的那個問題，用一種不含有乳糖的media 做培養板就完事了。有意思的是，細菌有一種很有意思的特點，如果培養基裡有足量的glucose，細菌會優先攝取glucose，而不能攝取lactose。Bill studier 根據這個特點研究出一種可以自動誘導的培養基。這種培養基含有成比例的glucose 和lactose。細菌首先攝取glucose，不攝取lactose，當細菌長到一定密度，耗完glucose 之後，就開始攝取lactose，從而開始誘導表達。所以用這種培養基養菌，很省事，接種了第二天收細菌，提蛋白就行了。
最後Bill studier 老爺子特別強調的是細菌的供氧。氧氣是限制細菌生長最重要的瓶頸，如果有足夠氧氣在培養基裡面，大腸杆菌的密度可以從一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30！要提高培養瓶的供氧，可以用baffled flask。這種flask 的瓶底邊緣有幾處凹陷(類似於可樂塑料瓶底那樣的形狀)，能有效增加空氣的培養基的混合。
最後，詳細內容可以見下列文獻:
Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005)
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-2
作者已不可考，如有人知道請告知
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（三）不溶的sigma32
四月六號早上，我們開始了第一模塊的實驗，Burgess 教授負責。這老兄研究了一輩子E.Coli 的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一個蛋白質復合體，只有合成RNA 的活性，卻沒有識別DNA 的能力。Sigma 系列因子能夠識別啟動子, 並且與核心酶結合，從而實現轉錄。我們這個實驗的核心主角就是其中一個因子，叫sigma32。
Sigma32可以識別heat shock genes 的啟動子。Sigma 32 在大腸桿菌裡大量表達的時候，絕大部分形成了不溶的包涵體(inclusion body)，我們的任務就是要用變性劑溶解變性不溶的蛋白，然後做重折疊。所有的buffer 幾乎都已經配好了，所以直接做就行了。我們先用1% Triton 來溶解
細菌本身的一些蛋白，inclusion body 相當穩定，不溶於triton，所以這一步，絕大部分垃圾
就被去掉了。
下一步就是用變性劑來溶解inclusion body。用什麼好呢？Burgess 教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N-十二烷基肌氨酸鈉）是一種比較強的陰離子去垢劑，0.3%的濃度就可以讓包涵體
溶解。sarkosyl 的優點是，雖然在高濃度下有變性作用，低濃度下卻對蛋白質有穩定的作用。所以用sarkosyl 做重折疊之前的變性劑是再好也不過的了。Burgess 還要我們試了經典的 Gudn HCl（鹽酸胍)來變性，作為對比。inclusionbody 在這兩種變性劑下很容易就溶解了。然後我們得去掉變性劑，做重折疊。怎麼做呢？方法有很多種，最簡單的是透析，把變性劑全部換掉。這個方法Burgess 並不喜歡，因為，透析是個緩慢的過程。在透析袋裡面，蛋白的濃度還是很高。折疊中間產物容易相互接觸形成不溶的聚合物。另一種方法是突然稀釋變性的蛋白，由於蛋白濃度相對與透析低了很多，好一點。但是問題也是類似的。Burgess 提議用逐步滴加稀釋的辦法。就是放一大燒杯的緩衝液，裡面有一個磁石可以不斷混合液體，然後一滴一滴加入變性的蛋白溶液。由於燒杯裡的溶液蛋白量是逐漸增加的，所以一開始蛋白折疊中間產物能夠相互作用的幾率大大降低了。Burgess說的還真像那麼回事，可事實上，嘿嘿。我們先用試著重折疊Gudn HCl 溶解的Sigma32。一開始還好，滴到後來，溶液就變渾濁了，最後幾乎成了衝淡了的牛奶那樣的東東。Burgess臉色不好看，說不應該這樣的。我們一離心，沉澱出來一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清液跑了一個Poros HQ 50 陰離子交換柱，拿到的蛋白很少，回收率小於5%。失敗啊。從這裡開始，我要岔開一下，講一些跟這個模塊實驗沒太大關係，但是很有意思的東西。
（四）Hydrostatic pressure和跑小柱子的trick
Dr. Burgess 假定我們對蛋白質純化一無所知，所以講得很細緻。比如他特別提到了disposable column 的用法。這種小柱子很簡單，把beads 倒進去，沖洗一下就可以用來純化蛋白了，很方便。惟一的問題是，由於是依靠重力跑，速度有時候會十分慢。液體流經柱子速度由ydrostatic pressure (靜流體壓力）來決定。而hydrostatic pressure 又是由實際柱高(即液體經過的長度)來決定。如果你嫌液體流得太慢（尤其是洗柱子的時候），可以在柱子下端出口連一個長的塑膠管子或者針管，這樣速度會快很多。這是很簡單的小trick, 但我覺得對初做蛋白質純化的人還是很有幫助的。
我知道一個例子。我原來很喜歡女生A, 有一天晚上主動在她實驗室等她做完實驗，就開車送她回家。這一等不得了，從晚上七點等到了凌晨一點。這個過程中，她好像沒什麼事情，但是每隔20 分鐘，她就會去一次cold room。作完實驗了之後，我好奇的問她，到底是什麼試驗花了這麼長時間，結果她說她在用一個disposable column 純化蛋白，由於beads稍微多了一點，速度很慢，而protocol 有一步要求用數百毫升的洗液來衝洗柱子。所以她每隔二十分鐘就去加洗液，所以白白花了好幾個小時。我聽了之後都要ft 了,沒想到她們實驗室竟然沒有人告訴她, 有簡單的辦法可以讓柱子跑得快一點的。只要在下端出口加一個長管子，她至少可以少等兩個小時。
當然最簡單的辦法還不是這個，最簡單的辦法的是把盛有洗液的容器放高，然後利用虹吸的原理讓液體 源源不斷的流經柱子。同時，柱子的下端連上塑膠管，彎成一個連通器，這個連通器的高度應該略高於柱面，這樣衝洗結束後，柱子就不會干。如果用這種方法，A就不用在實驗室待一晚上了，因為一切都是自動完成的。
我現在跟A已經完全沒有來往了, 但我對她映像還是十分深刻，主要就是因為她那晚跑柱子的經歷。話扯遠了，現在再回到蛋百質純化課。
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（三）不溶的sigma32
四月六號早上，我們開始了第一模塊的實驗，Burgess 教授負責。這老兄研究了一輩子E.Coli 的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一個蛋白質復合體，只有合成RNA 的活性，卻沒有識別DNA 的能力。Sigma 系列因子能夠識別啟動子, 並且與核心酶結合，從而實現轉錄。我們這個實驗的核心主角就是其中一個因子，叫sigma32。
Sigma32可以識別heat shock genes 的啟動子。Sigma 32 在大腸桿菌裡大量表達的時候，絕大部分形成了不溶的包涵體(inclusion body)，我們的任務就是要用變性劑溶解變性不溶的蛋白，然後做重折疊。所有的buffer 幾乎都已經配好了，所以直接做就行了。我們先用1% Triton 來溶解
細菌本身的一些蛋白，inclusion body 相當穩定，不溶於triton，所以這一步，絕大部分垃圾
就被去掉了。
下一步就是用變性劑來溶解inclusion body。用什麼好呢？Burgess 教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N-十二烷基肌氨酸鈉）是一種比較強的陰離子去垢劑，0.3%的濃度就可以讓包涵體
溶解。sarkosyl 的優點是，雖然在高濃度下有變性作用，低濃度下卻對蛋白質有穩定的作用。所以用sarkosyl 做重折疊之前的變性劑是再好也不過的了。Burgess 還要我們試了經典的 Gudn HCl（鹽酸胍)來變性，作為對比。inclusionbody 在這兩種變性劑下很容易就溶解了。然後我們得去掉變性劑，做重折疊。怎麼做呢？方法有很多種，最簡單的是透析，把變性劑全部換掉。這個方法Burgess 並不喜歡，因為，透析是個緩慢的過程。在透析袋裡面，蛋白的濃度還是很高。折疊中間產物容易相互接觸形成不溶的聚合物。另一種方法是突然稀釋變性的蛋白，由於蛋白濃度相對與透析低了很多，好一點。但是問題也是類似的。Burgess 提議用逐步滴加稀釋的辦法。就是放一大燒杯的緩衝液，裡面有一個磁石可以不斷混合液體，然後一滴一滴加入變性的蛋白溶液。由於燒杯裡的溶液蛋白量是逐漸增加的，所以一開始蛋白折疊中間產物能夠相互作用的幾率大大降低了。Burgess說的還真像那麼回事，可事實上，嘿嘿。我們先用試著重折疊Gudn HCl 溶解的Sigma32。一開始還好，滴到後來，溶液就變渾濁了，最後幾乎成了衝淡了的牛奶那樣的東東。Burgess臉色不好看，說不應該這樣的。我們一離心，沉澱出來一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清液跑了一個Poros HQ 50 陰離子交換柱，拿到的蛋白很少，回收率小於5%。失敗啊。從這裡開始，我要岔開一下，講一些跟這個模塊實驗沒太大關係，但是很有意思的東西。
（四）Hydrostatic pressure和跑小柱子的trick
Dr. Burgess 假定我們對蛋白質純化一無所知，所以講得很細緻。比如他特別提到了disposable column 的用法。這種小柱子很簡單，把beads 倒進去，沖洗一下就可以用來純化蛋白了，很方便。惟一的問題是，由於是依靠重力跑，速度有時候會十分慢。液體流經柱子速度由ydrostatic pressure (靜流體壓力）來決定。而hydrostatic pressure 又是由實際柱高(即液體經過的長度)來決定。如果你嫌液體流得太慢（尤其是洗柱子的時候），可以在柱子下端出口連一個長的塑膠管子或者針管，這樣速度會快很多。這是很簡單的小trick, 但我覺得對初做蛋白質純化的人還是很有幫助的。
我知道一個例子。我原來很喜歡女生A, 有一天晚上主動在她實驗室等她做完實驗，就開車送她回家。這一等不得了，從晚上七點等到了凌晨一點。這個過程中，她好像沒什麼事情，但是每隔20 分鐘，她就會去一次cold room。作完實驗了之後，我好奇的問她，到底是什麼試驗花了這麼長時間，結果她說她在用一個disposable column 純化蛋白，由於beads稍微多了一點，速度很慢，而protocol 有一步要求用數百毫升的洗液來衝洗柱子。所以她每隔二十分鐘就去加洗液，所以白白花了好幾個小時。我聽了之後都要ft 了,沒想到她們實驗室竟然沒有人告訴她, 有簡單的辦法可以讓柱子跑得快一點的。只要在下端出口加一個長管子，她至少可以少等兩個小時。
當然最簡單的辦法還不是這個，最簡單的辦法的是把盛有洗液的容器放高，然後利用虹吸的原理讓液體 源源不斷的流經柱子。同時，柱子的下端連上塑膠管，彎成一個連通器，這個連通器的高度應該略高於柱面，這樣衝洗結束後，柱子就不會干。如果用這種方法，A就不用在實驗室待一晚上了，因為一切都是自動完成的。
我現在跟A已經完全沒有來往了, 但我對她映像還是十分深刻，主要就是因為她那晚跑柱子的經歷。話扯遠了，現在再回到蛋百質純化課。
從純化到星辰——CSH 蛋白質純化課側記-1
作者已不可考，如有人知道請告知
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前言
2000年5月6日，我一個人在合肥三孝口書店閒逛，希望買點參考書帶出國去。我注意到有一本翻譯過來的書，書名叫做《蛋白質純化與鑒定實驗指南》。這本書很奇怪，裡面列出了很多具體實驗的步驟和解釋。我很快意識到，這本書實際上是冷泉港實驗室開設的一門《蛋白質純化與鑒定》實驗課的教材。
這本書深深的吸引了我，因為裡面記錄的實驗十分經典，涵蓋了蛋白質純化中可能用到的大部分手段，並且對實驗細節有十分詳盡的解釋。我對這本書愛不釋手，於是就買了下來, 而且當時就動了上這門課的念頭。這是一個很模糊的想法，沒有想到的是，五年以後這個想法竟然實現了。
這一系列文章是我對這次上課經歷的全面總結，一部分是八卦，一部分是流水帳般的記敘，還有一些是從這課程學到的tricks，最後也摻雜著自己過去做蛋白質純化的心得。想到哪說到哪，文字挺鬆散的，見笑了。
我來解釋一下標題。課程結束之後，每一個學員都有一份證書，印著Per Pura Ad Astra 幾個大字。這是拉丁語，直譯就是“從純化到星辰”。原始的諺語是,Per Aspera Ad Astra, 意思是through suffering to renown。所以“從純化到星辰”實際的意思是，做好蛋白質純化，以後
就容易出人頭地。呵呵。
（二）同學和老師
冷泉港的《蛋白質純化與鑒定》培訓班歷史相當悠久，從1989 年開始每年都開課，到今年是第十六次。每年都是四月初開始，持續兩個星期。值得一提的是，冷泉港有相當多的培訓班和會議，是一個科學家交流和學習的中心。這是冷泉港享有盛名的最主要原因。2004 年底, 我下定決心上這門課，於是遞交了申請。二月份的時候的到消息，我被錄取了，並且還有1000 刀的tuition waiver。可我還是高興不起來，因為還得解決1600 刀(學費一共2600 刀)。老板人很nice,但是他實在沒錢了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解決了，去年的退稅就這樣全搭進去了，欲哭無淚啊。
四月五號下午我趕到冷泉港，辦完登記手續後被告知晚上七點全體開會，與教員和同學見面。老師一共有四個，每人負責一個模塊的實驗，持續三天時間, 每個老師都有一兩個助手幫忙。學生則一共有16 個，分成四組，輪轉式的做完四個模塊。我這一組其他三個人是：來自colorado Boulder 的chad,做有絲分裂的；來自Princeton 的Adam，做海洋生物學的。Chad和Adam 都是博士後。第三個是來自丹麥的Charlotte，是個博士生，做植物的。
現在開始八卦一下幾個老師，^_^ 總負責人是來自wisconsin-madison 的Richard Burgess教授，這老頭很有意思，帶這個培訓班已經帶了十二年了，到現在還是樂此不疲。他六十年代是watson 的博士後，watson 似乎跟他關係很好，每年純化課的時候，watson 都會跑到培訓班的實驗室找Burgess 聊天，同時拉他去吃飯什麼的。後來的有一天，我還真的看到了watson 去找他聊天。不過令人驚訝的是，watson 此人相當有精神，走路像年輕人。watson 此人口碑很不好，很自大。連Burgess 教授一次和我們吃飯的時候都承認，watson 有時候口無遮攔，讓他都覺得很難堪。但是Burgess 又承認watson 對他自己的學生很支持，很提拔，這幾年又盡心盡力為冷泉港籌款，貢獻巨大。
第二位教員是來自UCLA 的Albert Courey 教授。這位教授人很nice 也很幽默，四位老師中我對他印象最好。申請這個課前，我先跟他發過e-mail 詢問這個課的情況，而他也鼓勵我申請。這老哥研究果蠅的,但是他卻負責教一組純化轉錄因子的實驗。我一開始不太理解，後來問他的學術經歷，才明白是怎麼回事。
原來這老哥博士是做生化，博後跟的是robert Tjian（錢澤南），還是做生化，研究轉錄因子。後來做了faculty 之後，決定用果蠅做模型來研究轉錄因子。他那時侯不懂果蠅的遺傳學，完全靠自學和到處問人。
我知道後覺得特別佩服，真正的科學家不應該被自己過去所受的訓練束縛死了，應該是根據研究的需要隨時準備學習新東西。這老哥雖然不是最年輕的，但是卻很能跟上年輕人的潮流，比如他說他有一個ipod mini,還在網上itunes 商店買過歌。我還跟他就ipod 聊了一陣子，因為我也有個ipod。
第三位教員是來自Texas MD anderson cancer center 的Sue-hwa Lin 教授。她是一個身材瘦小的中年婦女，台灣人，很搞笑，非常喜歡給我們講她博士後老板的笑話。一個笑話是這樣的, 有一天有一個學生向這個老兄投訴說和實驗室另一人有矛盾。這個老兄想了想，然後一本正經的說，和人產生矛盾了，一般有三種選擇。第一種呢，就是既然你恨他，那就殺了他好了。那個學生聽了之後，差點倒了。這個老兄說看起來你丫沒這膽量，那還有第二種選擇，就是殺了你自己。那個學生聽了幾乎要吐血。這老兄一看樂了，然後說你既然沒種殺人或者自殺，就剩第三種選擇了, 就是ignore that guy!!!哈。還有另一個笑話，Sue-hwa Lin 的博士後老板雖然當了老板，但是還是喜歡做實驗，並且和一個博後共用一個bench。有一天那個博後指著這老兄的鼻子說，XXX 呀，你把bench 弄得太亂了，趕快給我清理干淨了。這老兄聽了之後也不怒，而是慢條斯理的辯解說，每個人都有自己喜歡的工作方式，我喜歡亂，你丫管我呢，要是不喜歡，我們可以在bench 上畫條線劃清界線，從此井水不犯河水。哈哈哈。這老美連三八線都出來了。
第四位教授是rutgers university 的konstantin Severinov 副教授，這老兄是俄羅斯人，這四位老師中 最年輕的一位。此君滿頭亂髮，一臉大鬍子，看起來很邋遢，所以一開始我對他印象不佳。後來發現此人相當nice。Konstantin 特搞，有一次他做報告，他的電腦的桌面上有一堆亂七八糟的文件夾，其中有一個竟然是divorce!我告訴坐我旁邊的一個老美，老美說也注意到了，認為實在是很sad，呵呵。另外，他有兩個未成年的兒子，喜歡不斷打他手機。結果他常常講實驗講到一半就得停下來接電話。這個課結束之後，他還跑到冷泉港書店買了一堆蟲子毛絨玩具給兩個兒子做紀念品。舔犢情深，可見一班。
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前言
2000年5月6日，我一個人在合肥三孝口書店閒逛，希望買點參考書帶出國去。我注意到有一本翻譯過來的書，書名叫做《蛋白質純化與鑒定實驗指南》。這本書很奇怪，裡面列出了很多具體實驗的步驟和解釋。我很快意識到，這本書實際上是冷泉港實驗室開設的一門《蛋白質純化與鑒定》實驗課的教材。
這本書深深的吸引了我，因為裡面記錄的實驗十分經典，涵蓋了蛋白質純化中可能用到的大部分手段，並且對實驗細節有十分詳盡的解釋。我對這本書愛不釋手，於是就買了下來, 而且當時就動了上這門課的念頭。這是一個很模糊的想法，沒有想到的是，五年以後這個想法竟然實現了。
這一系列文章是我對這次上課經歷的全面總結，一部分是八卦，一部分是流水帳般的記敘，還有一些是從這課程學到的tricks，最後也摻雜著自己過去做蛋白質純化的心得。想到哪說到哪，文字挺鬆散的，見笑了。
我來解釋一下標題。課程結束之後，每一個學員都有一份證書，印著Per Pura Ad Astra 幾個大字。這是拉丁語，直譯就是“從純化到星辰”。原始的諺語是,Per Aspera Ad Astra, 意思是through suffering to renown。所以“從純化到星辰”實際的意思是，做好蛋白質純化，以後
就容易出人頭地。呵呵。
（二）同學和老師
冷泉港的《蛋白質純化與鑒定》培訓班歷史相當悠久，從1989 年開始每年都開課，到今年是第十六次。每年都是四月初開始，持續兩個星期。值得一提的是，冷泉港有相當多的培訓班和會議，是一個科學家交流和學習的中心。這是冷泉港享有盛名的最主要原因。2004 年底, 我下定決心上這門課，於是遞交了申請。二月份的時候的到消息，我被錄取了，並且還有1000 刀的tuition waiver。可我還是高興不起來，因為還得解決1600 刀(學費一共2600 刀)。老板人很nice,但是他實在沒錢了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解決了，去年的退稅就這樣全搭進去了，欲哭無淚啊。
四月五號下午我趕到冷泉港，辦完登記手續後被告知晚上七點全體開會，與教員和同學見面。老師一共有四個，每人負責一個模塊的實驗，持續三天時間, 每個老師都有一兩個助手幫忙。學生則一共有16 個，分成四組，輪轉式的做完四個模塊。我這一組其他三個人是：來自colorado Boulder 的chad,做有絲分裂的；來自Princeton 的Adam，做海洋生物學的。Chad和Adam 都是博士後。第三個是來自丹麥的Charlotte，是個博士生，做植物的。
現在開始八卦一下幾個老師，^_^ 總負責人是來自wisconsin-madison 的Richard Burgess教授，這老頭很有意思，帶這個培訓班已經帶了十二年了，到現在還是樂此不疲。他六十年代是watson 的博士後，watson 似乎跟他關係很好，每年純化課的時候，watson 都會跑到培訓班的實驗室找Burgess 聊天，同時拉他去吃飯什麼的。後來的有一天，我還真的看到了watson 去找他聊天。不過令人驚訝的是，watson 此人相當有精神，走路像年輕人。watson 此人口碑很不好，很自大。連Burgess 教授一次和我們吃飯的時候都承認，watson 有時候口無遮攔，讓他都覺得很難堪。但是Burgess 又承認watson 對他自己的學生很支持，很提拔，這幾年又盡心盡力為冷泉港籌款，貢獻巨大。
第二位教員是來自UCLA 的Albert Courey 教授。這位教授人很nice 也很幽默，四位老師中我對他印象最好。申請這個課前，我先跟他發過e-mail 詢問這個課的情況，而他也鼓勵我申請。這老哥研究果蠅的,但是他卻負責教一組純化轉錄因子的實驗。我一開始不太理解，後來問他的學術經歷，才明白是怎麼回事。
原來這老哥博士是做生化，博後跟的是robert Tjian（錢澤南），還是做生化，研究轉錄因子。後來做了faculty 之後，決定用果蠅做模型來研究轉錄因子。他那時侯不懂果蠅的遺傳學，完全靠自學和到處問人。
我知道後覺得特別佩服，真正的科學家不應該被自己過去所受的訓練束縛死了，應該是根據研究的需要隨時準備學習新東西。這老哥雖然不是最年輕的，但是卻很能跟上年輕人的潮流，比如他說他有一個ipod mini,還在網上itunes 商店買過歌。我還跟他就ipod 聊了一陣子，因為我也有個ipod。
第三位教員是來自Texas MD anderson cancer center 的Sue-hwa Lin 教授。她是一個身材瘦小的中年婦女，台灣人，很搞笑，非常喜歡給我們講她博士後老板的笑話。一個笑話是這樣的, 有一天有一個學生向這個老兄投訴說和實驗室另一人有矛盾。這個老兄想了想，然後一本正經的說，和人產生矛盾了，一般有三種選擇。第一種呢，就是既然你恨他，那就殺了他好了。那個學生聽了之後，差點倒了。這個老兄說看起來你丫沒這膽量，那還有第二種選擇，就是殺了你自己。那個學生聽了幾乎要吐血。這老兄一看樂了，然後說你既然沒種殺人或者自殺，就剩第三種選擇了, 就是ignore that guy!!!哈。還有另一個笑話，Sue-hwa Lin 的博士後老板雖然當了老板，但是還是喜歡做實驗，並且和一個博後共用一個bench。有一天那個博後指著這老兄的鼻子說，XXX 呀，你把bench 弄得太亂了，趕快給我清理干淨了。這老兄聽了之後也不怒，而是慢條斯理的辯解說，每個人都有自己喜歡的工作方式，我喜歡亂，你丫管我呢，要是不喜歡，我們可以在bench 上畫條線劃清界線，從此井水不犯河水。哈哈哈。這老美連三八線都出來了。
第四位教授是rutgers university 的konstantin Severinov 副教授，這老兄是俄羅斯人，這四位老師中 最年輕的一位。此君滿頭亂髮，一臉大鬍子，看起來很邋遢，所以一開始我對他印象不佳。後來發現此人相當nice。Konstantin 特搞，有一次他做報告，他的電腦的桌面上有一堆亂七八糟的文件夾，其中有一個竟然是divorce!我告訴坐我旁邊的一個老美，老美說也注意到了，認為實在是很sad，呵呵。另外，他有兩個未成年的兒子，喜歡不斷打他手機。結果他常常講實驗講到一半就得停下來接電話。這個課結束之後，他還跑到冷泉港書店買了一堆蟲子毛絨玩具給兩個兒子做紀念品。舔犢情深，可見一班。
2009年5月31日 星期日
新型恆溫式圈環形核酸增幅法(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)
關於LAMP的介紹可以看這邊
http://0rz.tw/tBdiz
設計LAMP primer的網站
http://primerexplorer.jp/e/index.html
會有這免費服務是因為原作者希望在這網站設計好直接跟他們訂購，
不過我們可以在這邊設計好，然後請國內合成，又快又省效果一樣。
http://0rz.tw/tBdiz
設計LAMP primer的網站
http://primerexplorer.jp/e/index.html
會有這免費服務是因為原作者希望在這網站設計好直接跟他們訂購，
不過我們可以在這邊設計好，然後請國內合成，又快又省效果一樣。
2009年5月25日 星期一
Hot Start Method
可以參考本篇
Haff, L (1993) PCR: applications and alternative technologies.
Biotechnology 11, 938-39.
意思是在 PCR 的機器到達你要 denature 的溫度的時候才把 sample 放下去
而不是先把 sample 放下去之後才開始讓他慢慢升溫這樣..
這樣可以防止在升溫過程中 primer 對於我們 sample 中的 template
non-specific 的 binding, 也就減少了 non-specific 片段的產生了。
Haff, L (1993) PCR: applications and alternative technologies.
Biotechnology 11, 938-39.
意思是在 PCR 的機器到達你要 denature 的溫度的時候才把 sample 放下去
而不是先把 sample 放下去之後才開始讓他慢慢升溫這樣..
這樣可以防止在升溫過程中 primer 對於我們 sample 中的 template
non-specific 的 binding, 也就減少了 non-specific 片段的產生了。
2009年5月22日 星期五
2009年5月21日 星期四
酒精代謝與痛風
肝細胞內有乙醇脫氫酵素，可將酒精（乙醇）脫氫轉換為乙醛，這一步是氧化反應，一定要搭配一個還原反應，那就是 NAD+ 同時得到氫與電子成為 NADH：
alchol + NAD+ ---> acetaldehyde + NADH
飲酒過量時，這個反應愈加快速，造成 NADH/NAD+ 的比值也愈高（NAD+ 不足），最後影響到其它需要 NAD+ 的反應平衡。其中最重要的就是丙酮酸與乳酸之間的氧化還原反應：
pyruvate + NADH ---> lactate + NAD+
上述反應由乳酸脫氫酵素 (lactate dehydrogenase) 催化。當NADH 過多時，反應平衡向右移動，使得肝臟即使在充氧狀態下還是會釋出乳酸（一般只有骨骼肌在劇烈運動、缺氧時才會產生乳酸）。急性飲酒過度者常有乳酸中毒 (lactic intoxication)或血液過酸 (acidosis) 現象，就是這個原理。
當血中乳酸高達某種程度以上，由於酸鹼平衡破壞、腎小管分泌尿酸不足之故，甚至會妨礙身體排除尿酸的效率，促使體內尿酸與鈉鹽結晶沉積，那就是痛風。
照這樣推理：原住民酒精代謝能力較強（有人猜測可能是他們的乙醇脫氫酵素活性高），當飲酒過量，食物中又富含核酸（代謝成尿酸）之時，便更容易有痛風症狀。
alchol + NAD+ ---> acetaldehyde + NADH
飲酒過量時，這個反應愈加快速，造成 NADH/NAD+ 的比值也愈高（NAD+ 不足），最後影響到其它需要 NAD+ 的反應平衡。其中最重要的就是丙酮酸與乳酸之間的氧化還原反應：
pyruvate + NADH ---> lactate + NAD+
上述反應由乳酸脫氫酵素 (lactate dehydrogenase) 催化。當NADH 過多時，反應平衡向右移動，使得肝臟即使在充氧狀態下還是會釋出乳酸（一般只有骨骼肌在劇烈運動、缺氧時才會產生乳酸）。急性飲酒過度者常有乳酸中毒 (lactic intoxication)或血液過酸 (acidosis) 現象，就是這個原理。
當血中乳酸高達某種程度以上，由於酸鹼平衡破壞、腎小管分泌尿酸不足之故，甚至會妨礙身體排除尿酸的效率，促使體內尿酸與鈉鹽結晶沉積，那就是痛風。
照這樣推理：原住民酒精代謝能力較強（有人猜測可能是他們的乙醇脫氫酵素活性高），當飲酒過量，食物中又富含核酸（代謝成尿酸）之時，便更容易有痛風症狀。
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代謝
2009年5月19日 星期二
DNA loading Dye
（4）10x loading buffer（pH7.0）
EDTA 50mM
甘油 20~50%
Xylene Cyanol FF（W/V） 0.25%
Bromophenol Blue（W/V） 0.25%
水
---------------------
100ml
EDTA 50mM
甘油 20~50%
Xylene Cyanol FF（W/V） 0.25%
Bromophenol Blue（W/V） 0.25%
水
---------------------
100ml
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prepare buffer
2009年5月18日 星期一
peptide marker配法
由GE Healthcare購得，貨號：71-5019-34
分子量由2512-16949，可用來跑Tricine Gel
加2ml buffer (1%SDS(w/v)、8M Urea、1%(v/v) 2-mercaptoethanol、0.01M Tris)調pH值至6.8，
將2ml protein mixture分裝成250ulx8管，60℃加熱10分鐘，
取其中一管來分裝10ulx25小管，冰至-20℃，
剩餘7管250ul冰至-80℃，等需要再拿出來分裝。
分子量由2512-16949，可用來跑Tricine Gel
加2ml buffer (1%SDS(w/v)、8M Urea、1%(v/v) 2-mercaptoethanol、0.01M Tris)調pH值至6.8，
將2ml protein mixture分裝成250ulx8管，60℃加熱10分鐘，
取其中一管來分裝10ulx25小管，冰至-20℃，
剩餘7管250ul冰至-80℃，等需要再拿出來分裝。
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protein,
proteomics
自營菌跟異營菌的差別
以微生物解釋的話：
細菌利用營養的來源可分為兩類：
自營性 及 異營性細菌
自營性細菌：能自行合成所需能量(藉由光合作用or還原無機物)
異營性細菌：須依賴其他生物or有機物來獲得能量(高等動物、黴菌、多數細菌）
自營性細對菌營養需求有：
A.光合成獨立性營養微生物(Photoautotrophic microoraganisms)
利用光能，以CO2當作碳源合成碳水化合物等.....
如高等植物、綠藻、藍綠細菌
B.化學合成獨立性營養微生物(Chemoautotrophic microoraganisms)
還原無機物、無機鹽類，藉由電子轉移獲得能量.....
如硫磺菌、硝酸菌、亞硝酸菌等
異營性細菌對菌營養需求有：
c.光合成從屬性營養微生物(Photoheterotrophic microoraganisms)
能利用光源，但以有機物作為碳源者.....
少數，如紅色非硫球菌、紅色擬球菌
d.化學合成從屬性營養微生物(Chemoheterotrophic microoraganisms)
氧化有機物作為能量的來源.......
包括高等動物、黴菌、多數細菌、人類都是
細菌利用營養的來源可分為兩類：
自營性 及 異營性細菌
自營性細菌：能自行合成所需能量(藉由光合作用or還原無機物)
異營性細菌：須依賴其他生物or有機物來獲得能量(高等動物、黴菌、多數細菌）
自營性細對菌營養需求有：
A.光合成獨立性營養微生物(Photoautotrophic microoraganisms)
利用光能，以CO2當作碳源合成碳水化合物等.....
如高等植物、綠藻、藍綠細菌
B.化學合成獨立性營養微生物(Chemoautotrophic microoraganisms)
還原無機物、無機鹽類，藉由電子轉移獲得能量.....
如硫磺菌、硝酸菌、亞硝酸菌等
異營性細菌對菌營養需求有：
c.光合成從屬性營養微生物(Photoheterotrophic microoraganisms)
能利用光源，但以有機物作為碳源者.....
少數，如紅色非硫球菌、紅色擬球菌
d.化學合成從屬性營養微生物(Chemoheterotrophic microoraganisms)
氧化有機物作為能量的來源.......
包括高等動物、黴菌、多數細菌、人類都是
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FAQ
2009年5月17日 星期日
FPLC AND HPLC的差別
HPLC 是高效率液態層析儀，
你可以想像一般的管柱層析，只不過以高壓高流速來粹取，
優點是可回收樣品，注入的樣品量較少，分離樣品快速，
但這些都是針對在一般分析時的需求，
如果是針對需要回收樣品的話，它的量太少，需要多次分離，
雖然最近有可以一次打幾個mg的管柱出現，用於分離較低分子量的peptide，
例如我剛合成一段peptide，但可能不是很乾淨，
此時便可使用HPLC來分離出我需要的樣品。
FPLC 是快速液態層析儀，
其實其原理跟HPLC差不多，一樣是用pump來加壓加速分離的，
但它的管柱和HPLC不一樣，其管柱外殼一律是用塑膠材質，
故使用的壓力與流速，便不像HPLC那麼強，(哪種塑膠我就不知道囉)
它主要是用來分離蛋白質用的，可以分離的量也較大，
很多人一定會覺得奇怪，用HPLC也是一樣的呀，為何一定要用FPLC呢??
這是因為蛋白質可能會跟HPLC的金屬管壁鍵結(bind)在一起，
如此就得不到所要的蛋白質了，
且蛋白質也可能因為高壓而變性，也是得不到想要的蛋白質，
價格上HPLC較便宜，大概30萬就能買到不錯的了...
而FPLC就要很多錢囉，而且台灣這邊只有一個香港商的安法瑪亞在代理，
貴死囉，我實驗室那一台沒有電腦連線的好像就要五十萬吧，型號我忘了，
在維修上呢，HPLC較FPLC簡單(找人來一下子就解決了)，FPLC常出問題，
一下子O ring老化要換，一下子pump的酒精不夠要加，
而當過壓的情形太常發生時，就代表著過濾部份的membrane要換了...
煩的呢...
你可以想像一般的管柱層析，只不過以高壓高流速來粹取，
優點是可回收樣品，注入的樣品量較少，分離樣品快速，
但這些都是針對在一般分析時的需求，
如果是針對需要回收樣品的話，它的量太少，需要多次分離，
雖然最近有可以一次打幾個mg的管柱出現，用於分離較低分子量的peptide，
例如我剛合成一段peptide，但可能不是很乾淨，
此時便可使用HPLC來分離出我需要的樣品。
FPLC 是快速液態層析儀，
其實其原理跟HPLC差不多，一樣是用pump來加壓加速分離的，
但它的管柱和HPLC不一樣，其管柱外殼一律是用塑膠材質，
故使用的壓力與流速，便不像HPLC那麼強，(哪種塑膠我就不知道囉)
它主要是用來分離蛋白質用的，可以分離的量也較大，
很多人一定會覺得奇怪，用HPLC也是一樣的呀，為何一定要用FPLC呢??
這是因為蛋白質可能會跟HPLC的金屬管壁鍵結(bind)在一起，
如此就得不到所要的蛋白質了，
且蛋白質也可能因為高壓而變性，也是得不到想要的蛋白質，
價格上HPLC較便宜，大概30萬就能買到不錯的了...
而FPLC就要很多錢囉，而且台灣這邊只有一個香港商的安法瑪亞在代理，
貴死囉，我實驗室那一台沒有電腦連線的好像就要五十萬吧，型號我忘了，
在維修上呢，HPLC較FPLC簡單(找人來一下子就解決了)，FPLC常出問題，
一下子O ring老化要換，一下子pump的酒精不夠要加，
而當過壓的情形太常發生時，就代表著過濾部份的membrane要換了...
煩的呢...
2009年5月16日 星期六
DNA gel 與 RNA gel的差異
Run RNA gel的buffer通常是MOPS, formaldehyde是加在gel中,而且sample
在run之前要先煮過 ，至於DNA gel,一般是TAE或TBE buffer
因為單股RNA容易形成secondary structure
造成立體形狀不同->影響在gel中移動的速度
這樣跑出來的速度跟base數就不是一個比例的關係
所以用高溫denature->RNA恢復單股 formadehyde防止RNA再形成secondary structure
這樣速度才會只決定於RNA之大小
在run之前要先煮過 ，至於DNA gel,一般是TAE或TBE buffer
因為單股RNA容易形成secondary structure
造成立體形狀不同->影響在gel中移動的速度
這樣跑出來的速度跟base數就不是一個比例的關係
所以用高溫denature->RNA恢復單股 formadehyde防止RNA再形成secondary structure
這樣速度才會只決定於RNA之大小
2009年5月15日 星期五
2009年5月14日 星期四
動物的生化路徑
上 kegg http://www.genome.jp/kegg/pathway.html
選你想看的代謝途徑
這裡舉糖解作用 http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00010.html
可以在選單中 選你想要看的物種
map上就會把該物種有的酵素 途徑 用顏色標示出來
選人類 就變這樣
http://www.genome.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=hsa&mapno=00010
選你想看的代謝途徑
這裡舉糖解作用 http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00010.html
可以在選單中 選你想要看的物種
map上就會把該物種有的酵素 途徑 用顏色標示出來
選人類 就變這樣
http://www.genome.jp/dbget-bin/get_pathway?org_name=hsa&mapno=00010
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實用網站
濃縮protein的方法
1. 加熱或是抽乾是個方法 但無法去鹽 假使鹽過高 會造成跑的很醜
2. 如果只是要loading gel check protein, 用 centricon 太貴(約兩百到四百元)
不合乎成本
3. 用硫酸胺沉澱後透析 太花時間. 用acetone 沉澱 會loss 掉一些protein
我的解決方式 自製centricon..
把你的sample 取約 50uL 放到 eppandrof 的蓋子的凹槽
上面加個透析膜 (約1平方公分) 蓋緊
約 3000rpm 離心個數分鐘到數十分鐘 即可濃縮 又不太貴
出來後的體積約 10uL 剛好夠你跑電泳
不過操作時手要細點
2. 如果只是要loading gel check protein, 用 centricon 太貴(約兩百到四百元)
不合乎成本
3. 用硫酸胺沉澱後透析 太花時間. 用acetone 沉澱 會loss 掉一些protein
我的解決方式 自製centricon..
把你的sample 取約 50uL 放到 eppandrof 的蓋子的凹槽
上面加個透析膜 (約1平方公分) 蓋緊
約 3000rpm 離心個數分鐘到數十分鐘 即可濃縮 又不太貴
出來後的體積約 10uL 剛好夠你跑電泳
不過操作時手要細點
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labtech,
protein,
proteomics
比活性的定義
抽出液中含有的酵素活性單位:
抽出液中含有多種蛋白質，這些蛋白質中，有些則具有某些酵素活性。例如，種子抽出液
中，含有多種酵素，其中有一種即為a-amylase。抽出液中，某一種酵素含有多少量，通
常以實際的酵素活性表示，常用的單位有兩種:
(a) 以units/ml表示，即1 ml 的抽出液中含有多少unit (單位)的該種酵素活性。
(b) 以unit/mg表示，即抽出液中，每1 mg 的蛋白質含有多少unit (單位)的該種酵素活
性，此表示方法，稱為抽出液中所含有該酵素的比活性(specific activity)。對某一酵
素而言，抽出液的比活性愈高，則抽出液含有該酵素的純度愈高。
(2) 酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)
的量。受質減少(或產物增加)的量，可視實驗的需求或方便性，以莫耳(mole)、克(g)、
OD吸光值等表示。例如: 1 unit 可表示在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1
mmole; 亦可表示為在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1 mg; 或可表示為在一分鐘
內，可使受質的OD吸光值減少0.1 (或是0.01等等)。
例如:
O. D.值變化量
活性 = ------------------------
(樣品蛋白質含量) X (反應時間-分鐘)
抽出液中含有多種蛋白質，這些蛋白質中，有些則具有某些酵素活性。例如，種子抽出液
中，含有多種酵素，其中有一種即為a-amylase。抽出液中，某一種酵素含有多少量，通
常以實際的酵素活性表示，常用的單位有兩種:
(a) 以units/ml表示，即1 ml 的抽出液中含有多少unit (單位)的該種酵素活性。
(b) 以unit/mg表示，即抽出液中，每1 mg 的蛋白質含有多少unit (單位)的該種酵素活
性，此表示方法，稱為抽出液中所含有該酵素的比活性(specific activity)。對某一酵
素而言，抽出液的比活性愈高，則抽出液含有該酵素的純度愈高。
(2) 酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)
的量。受質減少(或產物增加)的量，可視實驗的需求或方便性，以莫耳(mole)、克(g)、
OD吸光值等表示。例如: 1 unit 可表示在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1
mmole; 亦可表示為在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1 mg; 或可表示為在一分鐘
內，可使受質的OD吸光值減少0.1 (或是0.01等等)。
例如:
O. D.值變化量
活性 = ------------------------
(樣品蛋白質含量) X (反應時間-分鐘)
PCR中DMSO應該加多少
每個condition都不太一樣，所以通常會從2% 4% 6% 8% 開始試
然後加DMSO會幫助primer secondary structure解開，有助於跟template 作用
然後加DMSO會幫助primer secondary structure解開，有助於跟template 作用
RT-PCR、PCR、Real time-PCR
先簡單介紹聚合鏈反應(PCR, polymerase chain reaction)吧！聚合酵素(polymerase)是負責DNA合成的酵素，在1955年發現，一開始生物學家的想法很簡單，就是模仿生物體內的反應，把模板
DNA(template)和引信(primer)加上合成DNA的原料(dNTP,核甘三磷酸)以及聚合酵素放在一起，應該就可以在一個試管內產生DNA合成的反應，這樣的方式比藉由細菌增殖質體(plasmid)內所夾帶的特定基因還要快速簡單得多，隨後1977年在溫泉中發現的ThermusAquaticus細菌中所含有的聚合酵素(俗稱Taq polymerase)，因為具有耐高溫的特性，所以能夠勝任PCR的循環(cycle)主要三步驟:變性(denaturation)、引信附著(annealing)、聚合化(polymeration)，要以少數的模板合成大量的DNA需要20至30個循環，一開始的酵素是由大腸桿菌分離的Klenow片段(fragment of Klenow)，並不耐高溫，直至Taq聚合酵素被發現後才真正造成PCR實驗的重大突破。
那麼RT-PCR又是什麼東東呢？RT指的是逆轉錄?(reverse transcriptase)，也就是把RNA
轉錄成DNA的酵素，因為一般生物原則(dogma)是DNA轉錄成RNA，再由RNA轉譯成蛋白質，
所以由RNA變成DNA便被視為一種逆向轉換，才加上reverse，RNA病毒(例如愛滋病)就是靠
著合成這樣的酵素才得以將RNA轉變成DNA。RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄
為DNA，再進行聚合?反應，這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一，因為分解RNA的酵素
(RNase)無處不在，只要溫度一升高，RNA就非常容易被分解，科學家們只好先將它轉變為
互補DNA(cDNA)，再進行聚合脢反應。
至於即時RT-PCR(real time RT-PCR)則是利用非常敏感的螢光染劑(例如Sybr Green)，當
試管內形成雙股DNA時，這個螢光染劑就會與之結合並且大放光芒，機器在每一個循環都
紀錄釋出的螢光指數，由於聚合連鎖反應會造成DNA成對數性的增加(每個循環就增加2倍
，那30個循環就會增加2的30次方倍)，螢光指數也會隨著DNA的複製(形成雙股)而增加，
科學家發現一件很有趣的事，螢光指數突然開始快速增長的某個循環(這個加速的起點是
由一個叫做threshold的值來定義)，這個循環則稱為Ct(cycle of threshold)的值與起初
cDNA的含量成反比(當然，只限於同一次PCR反應中的比較性定量)，也因為這個發現，所
以我們能夠用推測當初的RNA含量，進而研究細胞內基因表現的變化。這又要說到PCR是非
常不精確的一種反應，我們拿等量的DNA來進行同一個PCR，30個循環之後，所得到的
band(我們把反應後的產物拿去跑電泳，溴乙烷ethyl bromide染色後用放射顯影
autoradiography後呈現的條狀影像)很有可能會有不一樣的粗細程度，所以嚴格來說PCR
是不能用來定量的，然而即時聚合鏈反應則由於使用了敏感的螢光劑，所以突破了這個限
制，在嚴格的控管情形下，是可以定量細胞內基因的表現程度的。
DNA(template)和引信(primer)加上合成DNA的原料(dNTP,核甘三磷酸)以及聚合酵素放在一起，應該就可以在一個試管內產生DNA合成的反應，這樣的方式比藉由細菌增殖質體(plasmid)內所夾帶的特定基因還要快速簡單得多，隨後1977年在溫泉中發現的ThermusAquaticus細菌中所含有的聚合酵素(俗稱Taq polymerase)，因為具有耐高溫的特性，所以能夠勝任PCR的循環(cycle)主要三步驟:變性(denaturation)、引信附著(annealing)、聚合化(polymeration)，要以少數的模板合成大量的DNA需要20至30個循環，一開始的酵素是由大腸桿菌分離的Klenow片段(fragment of Klenow)，並不耐高溫，直至Taq聚合酵素被發現後才真正造成PCR實驗的重大突破。
那麼RT-PCR又是什麼東東呢？RT指的是逆轉錄?(reverse transcriptase)，也就是把RNA
轉錄成DNA的酵素，因為一般生物原則(dogma)是DNA轉錄成RNA，再由RNA轉譯成蛋白質，
所以由RNA變成DNA便被視為一種逆向轉換，才加上reverse，RNA病毒(例如愛滋病)就是靠
著合成這樣的酵素才得以將RNA轉變成DNA。RT-PCR的定義就是將目標細胞內的RNA逆轉錄
為DNA，再進行聚合?反應，這是一種分析細胞內RNA表現的方法之一，因為分解RNA的酵素
(RNase)無處不在，只要溫度一升高，RNA就非常容易被分解，科學家們只好先將它轉變為
互補DNA(cDNA)，再進行聚合脢反應。
至於即時RT-PCR(real time RT-PCR)則是利用非常敏感的螢光染劑(例如Sybr Green)，當
試管內形成雙股DNA時，這個螢光染劑就會與之結合並且大放光芒，機器在每一個循環都
紀錄釋出的螢光指數，由於聚合連鎖反應會造成DNA成對數性的增加(每個循環就增加2倍
，那30個循環就會增加2的30次方倍)，螢光指數也會隨著DNA的複製(形成雙股)而增加，
科學家發現一件很有趣的事，螢光指數突然開始快速增長的某個循環(這個加速的起點是
由一個叫做threshold的值來定義)，這個循環則稱為Ct(cycle of threshold)的值與起初
cDNA的含量成反比(當然，只限於同一次PCR反應中的比較性定量)，也因為這個發現，所
以我們能夠用推測當初的RNA含量，進而研究細胞內基因表現的變化。這又要說到PCR是非
常不精確的一種反應，我們拿等量的DNA來進行同一個PCR，30個循環之後，所得到的
band(我們把反應後的產物拿去跑電泳，溴乙烷ethyl bromide染色後用放射顯影
autoradiography後呈現的條狀影像)很有可能會有不一樣的粗細程度，所以嚴格來說PCR
是不能用來定量的，然而即時聚合鏈反應則由於使用了敏感的螢光劑，所以突破了這個限
制，在嚴格的控管情形下，是可以定量細胞內基因的表現程度的。
quantitative/semi-quantitative RT-PCR
絕對定量(absolute quantitation)要先用已知濃度的相同東西做出一條standard curve
(如果要測total RNA,就用已知濃度的total RNA做standard curve)
利用內插法求你的sample濃度
當然,PCR本身的一些細節條件如saturation的事情就不在這裡討論
至於半定量(semi-quantitation)則是利用一個大家都有,而且量差不多的東西
(像是house keeping gene)當作分母一樣的東西
在相同反應條件下,每一個sample都跟分母比後再做比較
你如果要問quantitative PCR,不知道是不是要問real-time quantitative PCR?
如果是的話,基本上它也分成absolute/semi quantitative
只是偵測的方式跟傳統run gel的方式不一樣,
它可以偵測到PCR的gerometric phase,這是PCR當中最符合y=2^n的時期
所以可以避開saturation的問題
(如果要測total RNA,就用已知濃度的total RNA做standard curve)
利用內插法求你的sample濃度
當然,PCR本身的一些細節條件如saturation的事情就不在這裡討論
至於半定量(semi-quantitation)則是利用一個大家都有,而且量差不多的東西
(像是house keeping gene)當作分母一樣的東西
在相同反應條件下,每一個sample都跟分母比後再做比較
你如果要問quantitative PCR,不知道是不是要問real-time quantitative PCR?
如果是的話,基本上它也分成absolute/semi quantitative
只是偵測的方式跟傳統run gel的方式不一樣,
它可以偵測到PCR的gerometric phase,這是PCR當中最符合y=2^n的時期
所以可以避開saturation的問題
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FAQ
70%酒精的效果
因為70%酒精的分子跟水的比例是1:1
且酒精本身會自己耦合成一個小球可以把水包在裡面
其實那聚成小球後，酒精的親油端會露出，親水端是包在裡面的
因此，當70%酒精跟細菌放在一起的時候
酒精的親油端會很輕鬆的「插」上細胞膜，就可以深入細胞膜把內部的蛋白質去活性了
那一定有別的問題呀！純酒精呢....
因為純的本身並不一定有一個固定的位置「插」上細胞膜
加上酒精本身濃度高滲不進去，在外面把細胞外的蛋白質去活性後
ㄟ~~~就會發現細菌多了一層硬硬的殼了！
這樣有了「裝甲」，怎麼可能那麼容易被穿過
所以就無法殺菌了
且酒精本身會自己耦合成一個小球可以把水包在裡面
其實那聚成小球後，酒精的親油端會露出，親水端是包在裡面的
因此，當70%酒精跟細菌放在一起的時候
酒精的親油端會很輕鬆的「插」上細胞膜，就可以深入細胞膜把內部的蛋白質去活性了
那一定有別的問題呀！純酒精呢....
因為純的本身並不一定有一個固定的位置「插」上細胞膜
加上酒精本身濃度高滲不進去，在外面把細胞外的蛋白質去活性後
ㄟ~~~就會發現細菌多了一層硬硬的殼了！
這樣有了「裝甲」，怎麼可能那麼容易被穿過
所以就無法殺菌了
如何寫信跟外國學者要論文?
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
TITLE: reprint request
Dear Colleague, (or Dear Prof. XXX 或 Dear Dr. XXX)
I'd appreciate a copy of the following publication:
"想跟人家要的文獻列在這裡"
If available please send pdf versions to xxx@xxx (你的e-mail address)
or paper versions to:
XXX (你的大名)
XXXXXX (你的單位)
XXXXXXXXXX (地址)
TAIWAN (建議不要寫the Republic of China；無關政治，只是很容易寄到對岸)
Thank you
XX (你的名子)
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
這樣就可以了
當然，你還可以寫一些"我對你的研究很感興趣"之類的話
不過這並非必要，除非你很想藉此認識對方
並有意進一步交流，否則不用那麼麻煩
不過1994其實有點久
作者的e-mail address很可能沒效了
最好有心理準備
TITLE: reprint request
Dear Colleague, (or Dear Prof. XXX 或 Dear Dr. XXX)
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"想跟人家要的文獻列在這裡"
If available please send pdf versions to xxx@xxx (你的e-mail address)
or paper versions to:
XXX (你的大名)
XXXXXX (你的單位)
XXXXXXXXXX (地址)
TAIWAN (建議不要寫the Republic of China；無關政治，只是很容易寄到對岸)
Thank you
XX (你的名子)
+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
這樣就可以了
當然，你還可以寫一些"我對你的研究很感興趣"之類的話
不過這並非必要，除非你很想藉此認識對方
並有意進一步交流，否則不用那麼麻煩
不過1994其實有點久
作者的e-mail address很可能沒效了
最好有心理準備
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conference,
paper
病毒如何保存?
病毒有那麼多種, 潛溶的, 慢的, 等等病毒不一, 這些答案都不是可以一蓋而論的.
以我知道的baculovirus來說, 在野外在陽光下,
赤裸的(as a viron)的baculovirus很快就失去活性了,
所以野生種的baculovirus需要形成polyhedra(occlusion bodies)遮蔽/保護
來存活. 等待適當時機來臨時(被吃到蟲肚裡頭pH升高時), 再打開釋出來感染.
實驗室中保存baculovirus通常是濾去細胞碎片後, 遮光在4度通常可保半年.
若放在-80C凍著可以放好幾年, 只是凍/融過程會失去不少活性.
應該不少80年代的baculovirus paper有講到. 你可以google baculovirus inactivation
或者參看baculovirus expression system manual, Clontech的或Pharmigen的都不錯.
以我知道的baculovirus來說, 在野外在陽光下,
赤裸的(as a viron)的baculovirus很快就失去活性了,
所以野生種的baculovirus需要形成polyhedra(occlusion bodies)遮蔽/保護
來存活. 等待適當時機來臨時(被吃到蟲肚裡頭pH升高時), 再打開釋出來感染.
實驗室中保存baculovirus通常是濾去細胞碎片後, 遮光在4度通常可保半年.
若放在-80C凍著可以放好幾年, 只是凍/融過程會失去不少活性.
應該不少80年代的baculovirus paper有講到. 你可以google baculovirus inactivation
或者參看baculovirus expression system manual, Clontech的或Pharmigen的都不錯.
細菌內的質體數目
事實上不會只有一個，不然的話平常我們作cloning怎會會得到那麼多plasmid呢?
再從另一個角度來看，質體有分成high-copy number及low-copy number
光從這二個名詞的存在，就可以知道細菌不可能絕對只能具有一個質體啦~
的確有的細菌的某種plasmid是只有一個，通常這種size都很大，
但是也不表示它沒有其他plasmid
plasmid有分成好多種incompatibility group
二種plasmid若是屬於同一group的成員，則只會有一種存於細菌中
所以可能會有一個細菌，同時含有五種group的plasmid，但是數目都不相等，接合時，
質體也可能會交換，像是一種稱為conjugative plasmid。
再從另一個角度來看，質體有分成high-copy number及low-copy number
光從這二個名詞的存在，就可以知道細菌不可能絕對只能具有一個質體啦~
的確有的細菌的某種plasmid是只有一個，通常這種size都很大，
但是也不表示它沒有其他plasmid
plasmid有分成好多種incompatibility group
二種plasmid若是屬於同一group的成員，則只會有一種存於細菌中
所以可能會有一個細菌，同時含有五種group的plasmid，但是數目都不相等，接合時，
質體也可能會交換，像是一種稱為conjugative plasmid。
生技實驗中有那些方法可用以破壞菌體細胞?
打破菌體的方法，主要可分兩類：
1.物理法
a.使用機械力，如研磨、壓力、超音波震盪等等
b.使用溫度變化，如液態氮或負70度C冷凍使菌體內的水因此
變成固態結晶，而破壞其細胞膜等結構，
待解凍後就會使該部分產生孔洞。
2.化學法
a.利用鹽濃度不同導致滲透壓差異，使細菌漲破。
b.使用藥劑或酵素分解其細胞膜
吾人常用的solution I、II系列即綜合使用上述觀念，另外
某Q牌kit教人在其lysis buffer中加入lysozyme也是這個原因。
c.利用熱使細胞膜破裂，算是既有物理法也有化學法，一方面
使用熱使細胞澎漲同時脂質流動性增高進而導致細胞瓦解，
另一方面，熱使得細胞膜上的蛋白質等變性而失去功能等。
1.物理法
a.使用機械力，如研磨、壓力、超音波震盪等等
b.使用溫度變化，如液態氮或負70度C冷凍使菌體內的水因此
變成固態結晶，而破壞其細胞膜等結構，
待解凍後就會使該部分產生孔洞。
2.化學法
a.利用鹽濃度不同導致滲透壓差異，使細菌漲破。
b.使用藥劑或酵素分解其細胞膜
吾人常用的solution I、II系列即綜合使用上述觀念，另外
某Q牌kit教人在其lysis buffer中加入lysozyme也是這個原因。
c.利用熱使細胞膜破裂，算是既有物理法也有化學法，一方面
使用熱使細胞澎漲同時脂質流動性增高進而導致細胞瓦解，
另一方面，熱使得細胞膜上的蛋白質等變性而失去功能等。
degenerate primer
Degenerate nucleotide codes:
R=AG, Y=CT, M=AC, K=GT, W=AT, S=CG, B=CGT,
D=AGT, H=ACT, V=ACG, N=ACGT
R=AG, Y=CT, M=AC, K=GT, W=AT, S=CG, B=CGT,
D=AGT, H=ACT, V=ACG, N=ACGT
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FAQ
DNA在純水中能維持雙股嗎?
維持雙股要靠鹼基形成的氫鍵
在純水中並不會造成氫鍵的分開
重要的是"溫度"
溫度造成的分子擾動動能大於氫鍵鍵結力時
雙股就難以維持了
純水中水分子對DNA形成氫鍵的機會會大於含鹽類的水溶液
水分子對DNA形成的氫鍵會干擾DNA雙股間的鍵結力
所以在相同的擾動動能(溫度)情況下
水中的鹽類分子確實能幫助DNA雙股的穩定
但這不代表DNA在純水中無法形成雙股
溫度的影響通常會比鹽類的影響還要大的多
在純水中並不會造成氫鍵的分開
重要的是"溫度"
溫度造成的分子擾動動能大於氫鍵鍵結力時
雙股就難以維持了
純水中水分子對DNA形成氫鍵的機會會大於含鹽類的水溶液
水分子對DNA形成的氫鍵會干擾DNA雙股間的鍵結力
所以在相同的擾動動能(溫度)情況下
水中的鹽類分子確實能幫助DNA雙股的穩定
但這不代表DNA在純水中無法形成雙股
溫度的影響通常會比鹽類的影響還要大的多
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FAQ
TA cloning
2X Rapid ligation buffer(使用前先Vortex) 5μl
PGEM-T Vector 1μl
PCR product 2μl
T4 ligase 1μl
D.D H2O 1μl(與PCR product合起來3μl即可)
-----------------------------------------------------------
10μl
1.TA Sample 10μl+100μl comptent cells
↓ on ice 30 min
↓ 42℃ 2min
↓ on ice 2 min
2.加入400μl LB Medium
↓ 37℃ 1 Hr
3.加入75μl IPTG + 75μl X-gal
↓ Mix cell
4.塗plate (Sample 名、日期),1盤200μl
5.37℃ overnight (不可超過16Hrs)
------------------------------------------
挑藍白菌
1.取新plate，分20格。
2.將菌挑到新plate中，用滅菌棒劃菌。(藍菌挑兩個當Control)
3.37℃ overnight
4.用木棒挑一半Clony 插入eppendoff內，靜置15分鐘，攪拌。
(eppendoff要先加Lysis buffer，100μl/eppdoff)
(剩下的冰冰箱(4℃)，之後可抽質體)
5.攪拌成黏稠狀，丟棄木棒。
6.每管90μl phenol-chrolform mix well 離心12000 rpm,5 min
7.抽上層DNA 取8μl run gel(100volt 30 min)
Marker使用1kb，plasmid 為4kb圓型會run到2 kb的位置。
PGEM-T Vector 1μl
PCR product 2μl
T4 ligase 1μl
D.D H2O 1μl(與PCR product合起來3μl即可)
-----------------------------------------------------------
10μl
1.TA Sample 10μl+100μl comptent cells
↓ on ice 30 min
↓ 42℃ 2min
↓ on ice 2 min
2.加入400μl LB Medium
↓ 37℃ 1 Hr
3.加入75μl IPTG + 75μl X-gal
↓ Mix cell
4.塗plate (Sample 名、日期),1盤200μl
5.37℃ overnight (不可超過16Hrs)
------------------------------------------
挑藍白菌
1.取新plate，分20格。
2.將菌挑到新plate中，用滅菌棒劃菌。(藍菌挑兩個當Control)
3.37℃ overnight
4.用木棒挑一半Clony 插入eppendoff內，靜置15分鐘，攪拌。
(eppendoff要先加Lysis buffer，100μl/eppdoff)
(剩下的冰冰箱(4℃)，之後可抽質體)
5.攪拌成黏稠狀，丟棄木棒。
6.每管90μl phenol-chrolform mix well 離心12000 rpm,5 min
7.抽上層DNA 取8μl run gel(100volt 30 min)
Marker使用1kb，plasmid 為4kb圓型會run到2 kb的位置。
製作Competent cells
全程On ice
1.Stock cells 由-20(-80)℃解凍取20λ+20 ml LB (1%) ->37℃ overnight
取1%(200λ+20ml LB) -> refresh 2hr 37℃。
2.離心 8000 rpm,4℃,5min 去上清液 (flow 內執行)。
1~2 min
加CaCl2(100mM)10ml(1/2菌液量) 彈一彈打散----->離心5000rpm,5min,4℃
3.去上清液->加CaCl2 100mM with glycerol 3ml 打散 -->分裝300λ/eppendorf 約十管
於-20(-80)℃保存。
1.Stock cells 由-20(-80)℃解凍取20λ+20 ml LB (1%) ->37℃ overnight
取1%(200λ+20ml LB) -> refresh 2hr 37℃。
2.離心 8000 rpm,4℃,5min 去上清液 (flow 內執行)。
1~2 min
加CaCl2(100mM)10ml(1/2菌液量) 彈一彈打散----->離心5000rpm,5min,4℃
3.去上清液->加CaCl2 100mM with glycerol 3ml 打散 -->分裝300λ/eppendorf 約十管
於-20(-80)℃保存。
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E. Coli
HI test HA test
1.血球凝集反應之測定（Hemagglutination test, HA test）：用來測定雞隻對綿羊紅血
球所產生之免疫反應抗體力價。依據林等（1996）方法所述，其測定步驟簡述如下：
取待檢血清 0.025 ml 於 96 孔 U 型盤中以生理食鹽水做 2 倍連續稀釋後，滴
入1% 之綿羊紅血球懸浮液 0.025 ml 於 U 型盤每一孔中，振盪使混合均勻並靜置
2小時後，記錄產生凝集現象之最高稀釋濃度，取 log2 值即為該血清之抗體力價。
2.血球凝集抑制試驗（Hemagglutination inhibition test, HI test）：用來
測定雞隻對新城雞瘟疫苗所產生的免疫反應抗体力價。依據林等（1996）方法所述，
其測定步驟簡述如下：
取待測血清 0.025 ml，於 96 孔 U 型盤中以生理食鹽水做 2 倍連續稀釋後，每孔
加入 0.025 ml 8 單位之抗原稀釋液（省衛生試驗所製造），振盪使混合靜置 15 分鐘
後，每孔加入 1% 紅血球懸浮液 0.05 ml，靜置 1 小時後判定，如能完全抑制紅血球
凝集則判定為 "＋"，此稀釋濃度取 log2 值即為血清之力價。
球所產生之免疫反應抗體力價。依據林等（1996）方法所述，其測定步驟簡述如下：
取待檢血清 0.025 ml 於 96 孔 U 型盤中以生理食鹽水做 2 倍連續稀釋後，滴
入1% 之綿羊紅血球懸浮液 0.025 ml 於 U 型盤每一孔中，振盪使混合均勻並靜置
2小時後，記錄產生凝集現象之最高稀釋濃度，取 log2 值即為該血清之抗體力價。
2.血球凝集抑制試驗（Hemagglutination inhibition test, HI test）：用來
測定雞隻對新城雞瘟疫苗所產生的免疫反應抗体力價。依據林等（1996）方法所述，
其測定步驟簡述如下：
取待測血清 0.025 ml，於 96 孔 U 型盤中以生理食鹽水做 2 倍連續稀釋後，每孔
加入 0.025 ml 8 單位之抗原稀釋液（省衛生試驗所製造），振盪使混合靜置 15 分鐘
後，每孔加入 1% 紅血球懸浮液 0.05 ml，靜置 1 小時後判定，如能完全抑制紅血球
凝集則判定為 "＋"，此稀釋濃度取 log2 值即為血清之力價。
ELISA 血清分析
1. 將100μl/well antibody coated入 HB plate中央60 wells內。蓋上蓋子，
以溼紙巾包裹，置入夾鏈袋中，於37℃ 1hr/4℃ overnight/RT 2hr。
ps:使用PBS or Coating buffer將血清以1:200~1:3200、4G2抗體以1:1000 稀釋
2.使用PBST buffer 洗五次。
3.使用300μl Block Buffer 固定well，立即移除溶液。
4.乾燥plate
5.加入100μl/well 百倍稀釋的antigen，於4℃ overnight
-----------------------------隔天------------------
1.使用PBST洗五次
2.加入100μl/well 1:1000 6B6C-1-HRP 溶於5%牛奶中
3.加入100μl/well 1:100/200/400/800/1600 ANTI-JEV SERUM，於37℃ 1hr
4.洗plate(1,2) 10次，加入100μl/well substrate，室溫反應十分鐘後，加入50μl
2N H2SO4停止反應。
5.洗plate(3) 5次，加入1:1000稀釋(in 5% milk)的IgG HRP-conjugate，於37℃ 1hr
6.洗plate(3) 10次，加入100μl/well substrate，室溫反應十分鐘後，加入50μl
2N H2SO4停止反應。
以溼紙巾包裹，置入夾鏈袋中，於37℃ 1hr/4℃ overnight/RT 2hr。
ps:使用PBS or Coating buffer將血清以1:200~1:3200、4G2抗體以1:1000 稀釋
2.使用PBST buffer 洗五次。
3.使用300μl Block Buffer 固定well，立即移除溶液。
4.乾燥plate
5.加入100μl/well 百倍稀釋的antigen，於4℃ overnight
-----------------------------隔天------------------
1.使用PBST洗五次
2.加入100μl/well 1:1000 6B6C-1-HRP 溶於5%牛奶中
3.加入100μl/well 1:100/200/400/800/1600 ANTI-JEV SERUM，於37℃ 1hr
4.洗plate(1,2) 10次，加入100μl/well substrate，室溫反應十分鐘後，加入50μl
2N H2SO4停止反應。
5.洗plate(3) 5次，加入1:1000稀釋(in 5% milk)的IgG HRP-conjugate，於37℃ 1hr
6.洗plate(3) 10次，加入100μl/well substrate，室溫反應十分鐘後，加入50μl
2N H2SO4停止反應。
明欣定序流程
E-mail一定要填!!(結果會寄到e-mail)
產物代號、預期大小、Primer濃度
附照片(產物跑膠出來的照片，以利比對。)
附Primer。
用夾鏈帶封裝 產物、Primer(都要用石蠟封口)、照片
之後打電話叫人來取。(primer用小夾鏈袋另外分裝比較好)
定序Plasmid的要求濃度 50ng/ml 15ul
Primer(10uM) 5ul
每一條DNA都需要5ul的primer，要算好。
產物代號、預期大小、Primer濃度
附照片(產物跑膠出來的照片，以利比對。)
附Primer。
用夾鏈帶封裝 產物、Primer(都要用石蠟封口)、照片
之後打電話叫人來取。(primer用小夾鏈袋另外分裝比較好)
定序Plasmid的要求濃度 50ng/ml 15ul
Primer(10uM) 5ul
每一條DNA都需要5ul的primer，要算好。
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labtech,
sequencing
甲基纖維素配法
1.將水加熱至100℃，關加熱器，讓水稍冷。
2.加入甲基纖維素(配成2.2%)，以stir bar 攪拌overnight
3.autoclave
4.加入等量Medium(配成5%血清)，如養BHK21，則加入MEM。
2.加入甲基纖維素(配成2.2%)，以stir bar 攪拌overnight
3.autoclave
4.加入等量Medium(配成5%血清)，如養BHK21，則加入MEM。
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cell culture
[配藥] 各種Medium
MEM
FCS 100ml/1L
Medium E A A 1包/1L
NaHCO3 2.2g/1L
Antibody 4ml/1L
d.d.w 加至1L
(確認Powder包內容物，是否有含NEAA)
F12 F12配方的NaHCO3改為1.16/1L
C6/36 MEM再加HEPES 2g/1L
FCS 100ml/1L
Medium E A A 1包/1L
NaHCO3 2.2g/1L
Antibody 4ml/1L
d.d.w 加至1L
(確認Powder包內容物，是否有含NEAA)
F12 F12配方的NaHCO3改為1.16/1L
C6/36 MEM再加HEPES 2g/1L
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cell culture
Plaque assay 病毒斑測試
1.將BHK21稀釋成4x10(四次方)個細胞/ml，取4ml/well種入6孔培養盤，
約一天半可形成單層細胞。BHK21要留一點在Flask內繼續養。
2.以48孔培養盤進行病毒液稀釋，以十倍稀釋病毒液6~8次(50μl病毒液溶於450μl內。)
3.倒除預先準備好的六孔培養盤中的培養液，並加入200μl的病毒稀釋液，放置於37℃，
Co2培養箱內感染一小時，感染期間每20分鐘搖晃一次，不可讓細胞乾掉，使病毒液均
勻覆蓋及感染。
4.感染一小時候，吸除六孔培養盤內的病毒液，加入4ml/well甲基纖維素培養液(0.5L
2.2% methylcellulose (Sigma,USA)，5% FCS，50% MEM)
5.培養至出現病毒斑後(通常日本腦炎約3～4天、登革病毒約六～七天)，以10%福馬林-酒
精溶液(Wako,Japan)固定(1 ml/well)一小時。
6.倒掉六孔培養盤內的液體，加入0.5%結晶紫(crystal violet)進行細胞染色(1ml/well)
可以均勻分布即可，染色時間六小時(overnight)。
7.自來水清洗，計算病毒斑數量。
約一天半可形成單層細胞。BHK21要留一點在Flask內繼續養。
2.以48孔培養盤進行病毒液稀釋，以十倍稀釋病毒液6~8次(50μl病毒液溶於450μl內。)
3.倒除預先準備好的六孔培養盤中的培養液，並加入200μl的病毒稀釋液，放置於37℃，
Co2培養箱內感染一小時，感染期間每20分鐘搖晃一次，不可讓細胞乾掉，使病毒液均
勻覆蓋及感染。
4.感染一小時候，吸除六孔培養盤內的病毒液，加入4ml/well甲基纖維素培養液(0.5L
2.2% methylcellulose (Sigma,USA)，5% FCS，50% MEM)
5.培養至出現病毒斑後(通常日本腦炎約3～4天、登革病毒約六～七天)，以10%福馬林-酒
精溶液(Wako,Japan)固定(1 ml/well)一小時。
6.倒掉六孔培養盤內的液體，加入0.5%結晶紫(crystal violet)進行細胞染色(1ml/well)
可以均勻分布即可，染色時間六小時(overnight)。
7.自來水清洗，計算病毒斑數量。
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cell culture
SDS-PAGE 的定量
1.photoshop 可以用來定量，跑完膠掃描後藉由分析圖片
跟Marker band 的深淺比對知道蛋白質的量。
2.有paper使用image J來對照顏色
3.這種定量法不精確，只能參考用。
跟Marker band 的深淺比對知道蛋白質的量。
2.有paper使用image J來對照顏色
3.這種定量法不精確，只能參考用。
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proteomics
如何解開蛋白質三級結構?
最簡單先在NCBI網頁的STRUCTURE查此蛋白三級結構是否已被解出?如果沒有，但有相近的蛋白已被解過，就可以到http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html
左上方有個Modeling requests，點First Approach mode，再來就輸入自己的E-mail跟想預測的蛋白序列就可以了。
大概過了半天(4~8小時)就會寄個pdb file過來，他的原理是和已知結構的sequence做local比對,若相似就會有相同的folding方法，算是用cluster的方法，有些protein會預測的蠻準的。
但還是modeller的預測會好一些,因為他是利用給的sequence和已知結構的sequence做global比對,相似度高的再做類似的folding,所以會預測的準一些,只是缺點就是若你要的protein結構在database裡沒有相似的就比較容易預測失敗~
如果再不行
只好利用X-ray或NMR解了。
左上方有個Modeling requests，點First Approach mode，再來就輸入自己的E-mail跟想預測的蛋白序列就可以了。
大概過了半天(4~8小時)就會寄個pdb file過來，他的原理是和已知結構的sequence做local比對,若相似就會有相同的folding方法，算是用cluster的方法，有些protein會預測的蠻準的。
但還是modeller的預測會好一些,因為他是利用給的sequence和已知結構的sequence做global比對,相似度高的再做類似的folding,所以會預測的準一些,只是缺點就是若你要的protein結構在database裡沒有相似的就比較容易預測失敗~
如果再不行
只好利用X-ray或NMR解了。
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實用網站,
proteomics
預測電泳圖的網站
Biology Workbench:
http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi
要先註冊(很簡單), 然後進入"nucleic tools"
先"add new sequence"把你的序列存進去
然後選tool中的(TAGC), 基本上跟限制脢有關的資訊都會有了, 算是詳盡.
http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi
要先註冊(很簡單), 然後進入"nucleic tools"
先"add new sequence"把你的序列存進去
然後選tool中的(TAGC), 基本上跟限制脢有關的資訊都會有了, 算是詳盡.
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實用網站,
genomics,
proteomics
如何寄 Plasmid 到國外?
1.抽 mini 的 Plasmid 濃度就足夠，溶出後做一次retransformation濃度絕對綽綽有餘
2.3M paper 不需要什麼前置處理，乾淨就好
3.大概剪1.5~2公分見方的3M paper，劃上約1cm直徑的圓，再把DNA乾在圈圈裡，再用塑膠膜封口，或一般封口袋也可。
4.一次吸20~50ul，直接滴在 3M paper 上，一下就暈乾了。
5.室溫包裹或是一般平信即可
2.3M paper 不需要什麼前置處理，乾淨就好
3.大概剪1.5~2公分見方的3M paper，劃上約1cm直徑的圓，再把DNA乾在圈圈裡，再用塑膠膜封口，或一般封口袋也可。
4.一次吸20~50ul，直接滴在 3M paper 上，一下就暈乾了。
5.室溫包裹或是一般平信即可
2009年5月13日 星期三
好用的參考資料
http://idv.sinica.edu.tw/windfree/Information.htm
網站內容包括：
常用的酸與鹼
離心力換算
常用同位素物理性質
單位轉換
1 base nt (dNMP) = 325 Da
1 base pair nt (dsDNA) = 650 Da
1 kb ssDNA = 330 kDa
1 kb dsDNA = 660 kDa
1 kb ssRNA = 340 kDa
1 mg of 1 kb DNA = 1.52 pmol
1 pmol of 1 kb DNA = 0.66 mg
核酸 ( UV 吸光值)
dsDNA : A260 = 1 = ~ 50 mg/ml
ssDNA : A260 = 1 = ~ 33 mg/ml
ssRNA : A260 = 1 = ~ 40 mg/ml
p.s. 這些值是在微鹼性的環境下通過 1 cm 光徑所估計的
* 抽取出的純 DNA A260/A280 應該接近 1.8，<1.7 表示有些微蛋白質污染。
純 RNA 則應該接近 2.0。
蛋白質
1 a.a. = 110 Da
電泳解析度
蛋白脢抑制劑
緩衝液添加物
NaN3 (Sodium azide) 抑菌劑
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 除去二價金屬離子
β-ME (β-Mercaptoethanol) 抗氧化劑，也可防止雙硫鍵形成
DTT (Dithiothreitol) 抗氧化劑，也可防止雙硫鍵形成
BSA (bovine serum albumin) 安定劑
Tween-20 Triton X-100 界面活性劑
Glycerol, Glucose 抗凍劑
Urea 變性劑，主要破壞蛋白質2級結構
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 變性劑，主要破壞蛋白質3級結構
PMSF, TPCK, TLCK, benzamidine 蛋白脢抑制劑
常用抗生素
Phosphate Buffer 配製
網站內容包括：
常用的酸與鹼
離心力換算
常用同位素物理性質
單位轉換
1 base nt (dNMP) = 325 Da
1 base pair nt (dsDNA) = 650 Da
1 kb ssDNA = 330 kDa
1 kb dsDNA = 660 kDa
1 kb ssRNA = 340 kDa
1 mg of 1 kb DNA = 1.52 pmol
1 pmol of 1 kb DNA = 0.66 mg
核酸 ( UV 吸光值)
dsDNA : A260 = 1 = ~ 50 mg/ml
ssDNA : A260 = 1 = ~ 33 mg/ml
ssRNA : A260 = 1 = ~ 40 mg/ml
p.s. 這些值是在微鹼性的環境下通過 1 cm 光徑所估計的
* 抽取出的純 DNA A260/A280 應該接近 1.8，<1.7 表示有些微蛋白質污染。
純 RNA 則應該接近 2.0。
蛋白質
1 a.a. = 110 Da
電泳解析度
蛋白脢抑制劑
緩衝液添加物
NaN3 (Sodium azide) 抑菌劑
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 除去二價金屬離子
β-ME (β-Mercaptoethanol) 抗氧化劑，也可防止雙硫鍵形成
DTT (Dithiothreitol) 抗氧化劑，也可防止雙硫鍵形成
BSA (bovine serum albumin) 安定劑
Tween-20 Triton X-100 界面活性劑
Glycerol, Glucose 抗凍劑
Urea 變性劑，主要破壞蛋白質2級結構
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 變性劑，主要破壞蛋白質3級結構
PMSF, TPCK, TLCK, benzamidine 蛋白脢抑制劑
常用抗生素
Phosphate Buffer 配製
2009年4月24日 星期五
抽DNA、plasmid的Kit，內附Buffer配法
試劑配方：capture buffer:4.5M guanidine isothiocyanate
0.5M potassium acetate (pH5.0)
wash buffer:10mM potassium acetate (pH5.0)
16.7uM EDTA (pH8.0)
80% ethanol
Resuspension Solution (or Solution I):50mM Tris-HCl (pH7.5)
10mM EDTA (pH8.0)
100ug/mL RNase A
Lysis Solution (or Solution II):0.2M NaOH
1% SDS
Neutralization Solution (or Solution III):
4.09M guanidine hydrochloride
0.759M potassium acetate
adjust final pH to 4.2 with
glacial acetic acid
Wash Solution:60mM potassium acetate
8.3mM Tris-HCl (pH7.5)
0.04mM EDTA (pH8.0)
60% ethanol
0.5M potassium acetate (pH5.0)
wash buffer:10mM potassium acetate (pH5.0)
16.7uM EDTA (pH8.0)
80% ethanol
Resuspension Solution (or Solution I):50mM Tris-HCl (pH7.5)
10mM EDTA (pH8.0)
100ug/mL RNase A
Lysis Solution (or Solution II):0.2M NaOH
1% SDS
Neutralization Solution (or Solution III):
4.09M guanidine hydrochloride
0.759M potassium acetate
adjust final pH to 4.2 with
glacial acetic acid
Wash Solution:60mM potassium acetate
8.3mM Tris-HCl (pH7.5)
0.04mM EDTA (pH8.0)
60% ethanol
2009年4月8日 星期三
SDS PAGE 羞恥殿堂
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html
提供各種作壞了的 SDS PAGE 經驗以及解說問題所在。
這個站有很多實用的教學。
提供各種作壞了的 SDS PAGE 經驗以及解說問題所在。
這個站有很多實用的教學。
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實用網站,
proteomics
2009年4月1日 星期三
各種緩衝溶液配製方法
http://www.bioinformatics.org/JaMBW/5/4/index.html
當你想配各種不同濃度的Buffer時是不是算得頭昏眼花，
這個網站可以幫你算喔，只要輸入想配的PH值，用何種酸鹼，
方便又省事。
當你想配各種不同濃度的Buffer時是不是算得頭昏眼花，
這個網站可以幫你算喔，只要輸入想配的PH值，用何種酸鹼，
方便又省事。
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